Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Mittels quantitativer Real Time-PCR

Summary

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) ist ein wirksames Instrument zur mRNA-Spiegel in verschiedenen Insekten-Geweben und Entwicklungsstadien zu diagnostizieren. In diesem Bericht zeigen wir die Verwendung von qRT-PCR, um festzustellen mRNA-Spiegel in verschiedenen Larvenstadien Geweben und Entwicklungsstadien der invasiven Insektenarten, Smaragd Asche borer.

Abstract

Smaragd Asche borer (EAB,

Protocol

Die vollständige Protokoll mit den unterschiedlichen Schritten in dem Flussdiagramm in Abbildung 1 dargestellt. Einzelne Schritte bilden Dissektion, sind RNA-Extraktion, First Strand cDNA-Synthese und qRT-PCR weiter unten beschrieben.

I. Larven Dissection

1. Vor Beginn des Verfahrens, Ort Smaragd Asche borer oder EAB, Larven auf feuchten Papiertüchern bis Dissektionen durchgeführt werden. Halten Sie frisch zubereiteten 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder PBS, auf Eis, um den Puffer Kälte während der Zerlegung zu halten.
2. Um zu beginnen, fixieren die EAB Larven auf die Zerlegung Platte mit feinen Sezierung Pins. Dann fügen Sie kaltes 1X PBS, um die Zerlegung Platte.
3. Zunächst enthaupten Larven mit einem feinen Paar Dissektion Schere. Anschließend entfernen Sie das letzte Abdominalsegment der Larven.
4. Mit einem Uhrmacher Pinzette, heben Sie die Nagelhaut von der Larve Karkasse. Dann machen einen Schnitt entlang der Länge der Karkasse mit einer Schere. Achten Sie darauf, nicht zum Bruch des Darms, wie der Schnitt gemacht wird.
5. Sorgfältig isolieren Mitteldarm Gewebe aus anderen Geweben wie Fett Organe und Bindegewebe. Dann spülen Sie das Gewebe in frischem 1X PBS-Puffer, um sicherzustellen, dass es keine Verschmutzung der fatbody. Übertragen Sie die isoliert Mitteldarm zu 500 ul der vorgekühlte Trizolreagenz in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
6. Anschließend isolieren das Fett Körpergewebe mit einer Pinzette und übertragen sie in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 500 ul von gekühlten Trizolreagenz.
7. Schließlich trennen die Kutikula Gewebe aus dem Larvenstadium Karkasse durch Verschrottung off anhaftenden Gewebe, kümmert sich nicht um Gewebe Integrität beschädigen. Spülen Sie die isolierte Cuticula Gewebe in frischem PBS-Puffer und überträgt es auf einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 500 ul gekühlt Trizolreagenz.
8. Die isolierte fetten Körper, Haut-und Mitteldarm Gewebe kann bei -80 ° C gelagert werden, bis die RNA-Extraktion.
9. In Vorbereitung auf die RNA-Extraktion, sortieren Sie die verschiedenen EAB Proben nach den Entwicklungsstufen. Diese Stufen sind 1st-, 2nd-, 3rd-, und 4. Larvenstadien, prepupae und Erwachsene.

II. RNA-Extraktion (nach Herstellerangaben s-Protokoll für die Verwendung von Trizol Reagent)

Homogenisierung

1. Zu Beginn RNA-Extraktion, dem ersten Gebrauch Kunststoff Stößel zu den Geweben in der Trizol mit 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen zu homogenisieren. Nach der Homogenisierung, bring das Gesamtvolumen jeder Probe zu 1 ml mit dem Trizolreagenz.
2. Für die Entwicklungsstadien, homogenisieren ganze Tier in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser zerstoßen. Dann fügen Sie einen aliquoten Teil der Homogenat (50 ug) zu 1 ml Trizol.

Phasentrennung:

3. Inkubieren Sie die Probenröhrchen mit 1 mL Trizol für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Nach der Inkubation add 200 ul Chloroform in jedes Röhrchen. Unmittelbar nach Zugabe von Chloroform und schüttelt die Rohre kräftig für etwa 15 Sekunden. Dann die Röhrchen bei Raumtemperatur für weitere 2-3 Minuten.
5. Als nächstes Zentrifuge die Proben bei 12.000 xg für 15 Minuten bei 2 ° C. Nach Zentrifugation wird die RNA in der wässrigen Phase. Das Volumen der wässrigen Phase sollte 600 ul oder 60% des gesamten Volumens Trizol werden.

RNA Niederschläge

6. Entfernen Sie vorsichtig nur die wässrige Phase. Vorhandensein von Stoffen unterhalb der wässrigen Phase wird zu einer Kontamination der extrahierten RNA. Dann Transfer der wässrigen Phase in eine entsprechend beschriftete 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
7. Zur Fällung der RNA aus der wässrigen Phase, Mix 0,5 ml Isopropylalkohol in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Nach der Inkubation zentrifugieren bei 12.000 xg für 10 Minuten bei 2 ° C.

RNA Wash

8. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen aus den Rohren. RNA ist in der gelartigen Pellet am Boden des Röhrchens gebildet. Waschen des Pellets mit 75% Ethanol, Zugabe von mindestens 1 ml 75% Ethanol pro 1 ml Trizol. Durch Vortexen mischen. Dann zentrifugieren bei 7500Xg für 5 Minuten bei 2 ° C.

RNA Elution

9. Verwerfen Sie den Überstand aus den Rohren. Zentrifugieren wieder in dem kleinen Tisch-Zentrifuge für 1 Minute. Entfernen Sie überschüssiges Überstand aus der Tube durch vorsichtiges Pipettieren. Verlassen Sie die Röhre öffnen und das Pellet an der Luft trocknen für 5-10 Minuten. Achten Sie darauf, über trockene Pellet, da dies deutlich sinken wird seine Löslichkeit.
10. Nach Lufttrocknung, das Pellet in Diethylpyrocarbonat oder DEPC, behandeltes Wasser. Die Menge des Wassers verwendet werden, um das Pellet resuspendieren hängt von der Größe des Pellets ab. Verwenden Sie 50 ul DEPC behandeltem Wasser für eine smAlle Pellet oder 100 ul für eine große Pellets. Lassen Sie das Pellet vollständig in DEPC behandeltem Wasser auflösen, indem Sie die Pipettenspitze nach oben und unten mehrere Male.
11. Sobald das Pellet gelöst hat, legen Sie die Probe bei 55 ° C für 10 Minuten.
12. Dann messen die Konzentration der einzelnen RNA-Probe mit einem Nanodrop Spektralphotometer (2 ul der RNA-Probe).
13. Bewahren Sie die RNA-Proben bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

III. First-Strand cDNA-Synthese (nach Herstellerangaben s-Protokoll mit SuperScript Erststrangsynthese Kit von Invitrogen.)

1. Für jede RNA-Probe fügen Sie die folgende in einem PCR-Röhrchen:

   RNA	x ul
   10 mM dNTP-Mix M	1μl
   Oligo (dt) (0,5 ug / ul)	1 ul
   DEPC behandeltem Wasser	(8-x) ul
   Gesamtvolumen:	10 pl
   Hinweis: x ist das Volumen der RNA für die cDNA-Synthese eingesetzt. Je nach Konzentration der RNA, wird 2-3 pg RNA für jede Reaktion eingesetzt werden und das Gesamtvolumen der jeweiligen Reaktion sollte 10 pl werden.

2. Legen Sie die obige Reaktion Mix in einem Thermocycler bei 65 ° C für 4 Minuten.
3. Entfernen Sie die Schläuche von der theromocyler und legen sie auf Eis sofort für mindestens 2 Minuten.
4. Bereiten Sie den ersten Strang Master-Mix, indem Sie die folgenden:

   10x RT-Puffer	2μl
   25mM MgCl 2	4 ul
   0,1 M DTT	2 ul
   RNase aus	1 ul

5. Add 9 ul Mastermix in jedes Röhrchen mit der RNA-Probe, mischen Sie durch Pipettieren und Zentrifugieren der Mischung kurz.
6. Legen Sie die Rohre zurück in den Thermocycler und inkubieren für 2 Minuten bei 42 ° C.
7. Halten Sie den Thermocycler und fügen 1 ul Superscript II Reverse Transkriptase (Invitrogen) in jedes Röhrchen. Dieser Schritt sollte schnell erledigt werden.
8. Inkubieren Sie die Proben bei 42 ° C für 1,5 Stunden.
9. Beenden Sie die Reaktion bei 70 ° C für 15 Minuten.
10. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Thermocycler und legen sie auf Eis.
11. Add 1 ul RNase H zu jedem Röhrchen und legen Sie sie zurück in den Thermocycler bei 37 ° C für 20 Minuten.
12. Nach Entnahme der Proben aus dem Thermocycler, fügen Sie 20 ul Nuklease-freies Wasser in jedes Röhrchen. Das Volumen jeder Probe wird in dieser Phase verdoppelt.
13. Überprüfen Sie die Konzentration der einzelnen Proben unter Verwendung von 2 ul der Probe. Nehmen Aliquot jeder Probe, um die Konzentration von 20ng/μl für den Einsatz in qRT-PCR zu machen. Die Menge des Wassers, um die Proben auf eine Konzentration von 20ng/μl wird auf die anfängliche Konzentration der cDNA synthetisiert ab.

IV. qRT-PCR:

Primer Design und Bestimmung der Referenz-Gen

1. Design-Primer mit einer Schmelztemperatur (Tm) von 60 ° C und ein Produkt Größe von ~ 100 bp.
2. AP-PERI1 ist als das Gen von Interesse für dieses Experiment verwendet. Ein Verweis Gen oder interne Kontrollsystem ist für eine spätere Analyse und Normalisierung der Daten benötigt wird. Ribosomalen Protein (AP-RP1) wird als Referenz-Gen für dieses Experiment verwendet.
3. Bereiten 5um arbeiten Aktien der Primer, die verwendet werden, einschließlich Ihrer Referenz-Gen.

Vorbereitung der Standards

4. Um die Effizienz der Primer verwendet Standards vorgenommen werden sollten berechnen.
5. Machen Sie eine Mischung aus der cDNA aus den verschiedenen Proben, die getestet werden.
6. Machen 5X serielle Verdünnungen für jeden beliebigen Punkt in der Grafik. Vier Verdünnungen sollte genug sein, aber fünf sind sehr zu empfehlen.
7. Das Volumen variiert je nachdem, wie viele Punkte und wie viele technische Replikate verwendet werden. Es sollte ausreichen, um einen Standard für jedes Gen wird mit der entsprechenden Referenz-Gen getestet zu machen.

Platte Vorlage

8. Design-Vorlage zeigt den Namen des Samples für jeden gut in der qRT-PCR-Platte. Denken Sie daran, Standards für jedes Gen und mindestens zwei technische Replikate pro Probe sind.

Richten Sie das Rad Parameter

9. Schalten Sie die qRT-PCR-Maschine auf und geben Sie die Rad-Parameter. Die PCR-Parameter für dieses Experiment ist wie folgt:
   Schritt 1:
   • 1 Zyklus: 95 ° C 3 min
   Schritt 2:
   • 40 Zyklen: 95 ° C 15 sec, gefolgt von 60 ° C 30 sec
     (Optional: für die Bestimmung der Schmelzkurve die folgenden Schritte umfassen)
   Schritt 3:
   • 1 Zyklus: 95 ° C 1 min
   Schritt 4:
   • 1 Zyklus: 55 ° C 1 min
   Schritt 5:
   • 81 Zyklen: 55 ° C 30 sec

Platte einrichten für CFX96 (BioRad) Maschine

11. Bereiten Sie den Master-Mix für jedes Gen (einschließlich der Referenz-Gen) in separaten Röhrchen. Für jeden gut, besteht der Master-Mix

    Nuclease freies Wasser	2μl
    2,5 x SYBR green	4 ul
    Primer nach vorn	1 ul
    Primer reverse	1 ul
    Gesamtvolumen	8 ul

12. Während der Vorbereitung der Master-Mix enthalten 1-2 zusätzliche Reaktionen zu berücksichtigen Pipettierfehler.
13. Nach den zuvor entworfenen Vorlagen, fügen Sie 2 ul (20 ng / mL) der cDNA in jede Vertiefung. Dann fügen Sie 8 &mgr; l des Master-Mix in jede Vertiefung, was zu einem Gesamtvolumen von 10 ul pro Reaktion.
14. Pipette auf und ab (2-3X), um sicherzustellen, wird die Probe gut gemischt. Überprüfen Sie, dass keine Flüssigkeit an der Spitze bleibt. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen, verwenden Sie einen neuen Tipp für jede Probe.
15. Sobald die gesamte Platte eingerichtet ist, die Platte abgedeckt mit optischen Band. Berühren Sie das Band wie die Anwesenheit von Fett die Ablesung beeinträchtigen können. Dann Zentrifuge die Platte bei 500 rpm für 1 Minute, um sicherzustellen, dass alle Produkte in den Vertiefungen an der Unterseite der Platte sind.
16. Nach der Zentrifugation zu überprüfen, dass es kein Eis oder Wasser auf der Unterseite der Platte. Schließlich wird die Platte in der qRT-PCR-Maschine und führen Sie das PCR-Programm.

V. Schematische Darstellung des Experiments

Abbildung 1: Flussdiagramm, das die Reihenfolge der Schritte für die Genexpression zu untersuchen.

Abbildung 2: A) Larven EAB Dissektion zeigt Mitteldarm in der Mitte. B) isoliert Mitteldarm der Larven EAB

Abbildung 3: A) Mittlere relative Expression Werte (Umdrehungen) für eine peritrophin Gen (AP-PERI1) in verschiedenen Larvenstadien Gewebe einschließlich Cuticula (Cu), Mitteldarm (MG) ​​und Fettkörper (FB). Ein EAB bestimmten ribosomalen Protein (hier benannt, AP-RP1) wurde als interne Kontrolle für die Normalisierung der Daten für das Gen von Interesse, AP-PERI1 erhalten wird. B) Relative fache Änderung der AP-PERI1 in larvalen Geweben. Die Nagelhaut Gewebe zeigten die geringste Ausdruck und wurde deshalb als Kalibrator (1X) Probe (Pfaffl, 2001).

Abbildung 4: A) Mittlere relative Expression Werte (Umdrehungen) für eine peritrophin Gen (AP-PERI1) in verschiedenen Entwicklungsstadien der EAB einschließlich Larvenstadien (1., 2., 3. und 4.), prepupae (PP) und Erwachsene (A). Ein EAB bestimmten ribosomalen Protein (AP-RP1) wurde als interne Kontrolle für die Normalisierung der Daten für das Gen von Interesse, AP-PERI1 erhalten wird. B) Relative fache Änderung der AP-PERI1 in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die PP Probe zeigte die geringste Niveau der mRNA-Spiegel und war daher als Kalibrator (1X Probe) übernommen.

VI. Abschluss

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) ist ein wirksames Instrument zur mRNA-Spiegel in verschiedenen Insekten-Geweben und Entwicklungsstadien zu diagnostizieren. Ferner hat qRT-PCR meist das zentrale Instrument, um Daten von hoher Durchsatz Genexpressionsanalysen wie Microarrays und die neue Generation der RNA-Seq generiert validieren.

Discussion

Der Schwellenwert-Zyklen (Ct)-Wert für jede Probe in der qRT-PCR-Platte erhalten. Zur Herstellung der Standardkurve wurde die Ct-Wert für jede Verdünnung erhalten gegen den log der Konzentration aufgetragen. Die Ct-Werte für die experimentellen Proben wurden dann auf dieser Verdünnungsreihe Standardkurve aufgetragen. Ziel Mengen wurden aus separaten Standard-Kurven für jedes Experiment dh Gewebe-und Entwicklungs-Ausdruck erzeugt werden berechnet. Die relative Expression Werte (Umdrehungen) wurden dann durch Division der Mengen der Zielsequenz von Interesse (in diesem Fall AP-PERI1) mit der Menge für das interne Kontrollsystem erhalten (AP-RP1) bestimmt. Für die Berechnungen von Bedeutung waren die Protokolle der REVs für jedes Gen durch ANOVA (Analysis of Variance) mit Hilfe der PROC MIXED Prozedur von SAS (SAS Institute Inc. SAS / STAT Benutzer s Guide, Version 9.1) analysiert. Die Bedeutung der Expression wurde auf p <0,05 festgelegt. Relative fache Veränderungen im Falle von Gewebe wurden, indem sie die Kutikula Probe als Kalibrator (1X Probe, Pfaffl, 2001) berechnet. Deshalb wurden die Expression in den Mitteldarm und Fettkörper bezogen auf die Nagelhaut. Im Falle von Entwicklungs-Expression wurde das prepupal Probe als Kalibrator genommen. Für beide Studien, zwei Wiederholungen biologischen und drei technischen Replikaten verwendet wurden.

Unser Experiment zeigte sich signifikant (p <0,05) höhere AP-PERI1 Transkript in den Mitteldarm Gewebe (Abb. 3) im Vergleich zu anderen Geweben untersucht. Bei der Entwicklung der Fütterung Stufen (dh die Larvenstadien und erwachsene) waren signifikant (p <0,05) höher als die prepupae Probe (Abb. 4). Die am wenigsten mRNA-Spiegel wurden für Nagelhaut und prepupae (Abb. 3 und 4) berechnet. Da peritrophins integraler Bestandteil des Insekts Mitteldarm unsere Ergebnisse bestätigen frühere Ergebnisse in anderen Insektenarten (Mittapalli et al. 2007). Die Muster in den Entwicklungsstadien beobachtet bestätigen erneut die Funktion des AP-PER1 in Verdauung und Prozesse. Die weit verbreitete Bacillus thuringiensis (Bt) Giftstoffe in Kulturpflanzen in der Tat Ziel und stören die PM in Insekten (Pauchet et al., 2009). Daher könnten die Ergebnisse in dieser Studie zeigen nicht nur potentielle Kontrolle Ziele für EAB sondern auch grundlegende Kenntnisse darüber, wie invasive Insekten an ihre neue Umgebung anzupassen.