Análise de Expressão Gênica em Emerald Borer Ash ( Agrilus planipennis) Usando Quantitativa em Tempo Real-PCR

Summary

Quantitativas PCR em tempo real (qRT-PCR) é uma ferramenta eficaz para diagnosticar os níveis de mRNA nos tecidos do inseto e estágios diferentes de desenvolvimento. Neste relatório, nós mostramos o uso de qRT-PCR para verificar os níveis de mRNA em diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento larval das espécies de insetos invasivos, esmeralda broca cinzas.

Abstract

Emerald broca de cinzas (EAB,

Protocol

O protocolo completo, com diferentes passos é descrito no fluxograma na Figura 1. Medidas individuais que constituem a dissecação, extração de RNA, a síntese de cDNA e Strand Primeiro qRT-PCR são detalhados abaixo.

I. Dissecção larval

1. Antes do início deste procedimento, coloque broca cinzas Emerald, ou EAB, larvas com papel de filtro úmido, até dissecções são executadas. Mantenha recém-fosfato preparado 1X solução salina, ou PBS, em gelo para manter o frio em todo o buffer de dissecção.
2. Para começar, corrigir as larvas EAB na placa de dissecção com pinos de dissecção fina. Em seguida, adicione o frio 1X PBS para a placa de dissecação.
3. Primeiro, decapitar larvas com um belo par de tesouras de dissecação. Posteriormente, remover o último segmento abdominal das larvas.
4. Usando um par de fórceps relojoeiro, levante a cutícula da carcaça larval. Então, faça uma incisão ao longo do comprimento da carcaça usando um par de tesouras. Tome cuidado para não romper o intestino como a incisão é feita.
5. Cuidadosamente isolar o tecido do intestino médio de outros tecidos, como corpos de gordura e tecido conjuntivo. Depois, lave o tecido em tampão PBS 1X fresco para garantir que não há contaminação do fatbody. Transferir o intestino isolado para 500 mL de pré-refrigerados reagente Trizol em um tubo eppendorf 1,5 mL.
6. Em seguida, isolar o tecido de gordura corporal usando uma pinça e transferi-lo para um tubo eppendorf 1,5 mL contendo 500 mL de reagente Trizol refrigerados.
7. Finalmente, isolar o tecido cutícula da carcaça larval por demolição de desconto em qualquer tecido conjuntivo aderente, tomando cuidado para não prejudicar a integridade do tecido. Lave o tecido cutícula isolados em fresco tampão PBS e transferir para um tubo eppendorf 1,5 mL com 500 mL de reagente Trizol refrigerados.
8. O tecido adiposo isolado cutícula corpo, e intestino podem ser armazenadas a -80 ° C até a extração de RNA.
9. Em preparação para a extração de RNA, uma espécie EAB das amostras de acordo com os vários estágios de desenvolvimento. Estas etapas incluem 1, 2, 3, e 4 º ínstares prepupas e adultos.

II. Extração de RNA (Como protocolo do fabricante por s para o uso de reagente Trizol)

Homogeneização

1. Para começar a extração de RNA, primeiro use pilões de plástico para homogeneizar os tecidos do Trizol contendo tubos de 1,5 mL eppendorf. Após homogeneização, atingindo um volume total de cada mL de amostra para 1 com o reagente Trizol.
2. Para as fases de desenvolvimento, homogeneizar animal inteiro em nitrogênio líquido com um almofariz e um pilão. Em seguida, adicione uma alíquota do homogenato (50 mg) a 1 mL de Trizol.

Separação de fases:

3. Incubar os tubos de amostra com 1 mL Trizol por 15 minutos em temperatura ambiente.
4. Após a incubação, adicionar 200μL de clorofórmio para cada tubo. Imediatamente após a adição de clorofórmio, agitar os tubos vigorosamente por cerca de 15 segundos. Então, incubar os tubos em temperatura ambiente por mais 2-3 minutos.
5. Em seguida, centrifugue as amostras a 12.000 Xg por 15 minutos a 2 ° C. Após a centrifugação, o RNA será na fase aquosa. O volume da fase aquosa deve ser de 600 mL, ou 60% do volume total de Trizol.

RNA precipitação

6. Remova cuidadosamente apenas a fase aquosa. Presença de substâncias abaixo da fase aquosa vai causar contaminação do RNA extraído. Em seguida, transferir a fase aquosa para um 1,5 mL devidamente rotulados tubo eppendorf.
7. Para precipitar o RNA a partir da fase aquosa, misturar 0,5 mL de álcool isopropílico para cada tubo. Incubar as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, os tubos de centrífuga a 12.000 Xg por 10 minutos a 2 ° C.

RNA Wash

8. Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante dos tubos. RNA está presente no gel-like pellet formado no fundo do tubo. Lave o pellet com etanol 75%, somando pelo menos 1 mL de etanol 75% por 1 mL de Trizol. Misturar em vortex. Então, os tubos de centrífuga em 7500Xg por 5 minutos a 2 ° C.

RNA eluição

9. Desprezar o sobrenadante dos tubos. Centrifugue os tubos novamente na centrífuga pequena mesa por 1 minuto. Remova qualquer excesso de sobrenadante do tubo por pipetagem cuidadosa. Deixar o tubo aberto e deixar o ar seco pellet por 5-10 minutos. Tenha cuidado para não secar o pellet sobre como isso irá diminuir significativamente a sua solubilidade.
10. Após secagem ao ar, ressuspender o sedimento em diethylpyrocarbonate , ou DEPC, água tratada. A quantidade de água utilizada para ressuspender o sedimento vai depender do tamanho do pellet. Use 50 mL de água tratada DEPC para um smtodos mL pellet ou 100 para um pellet grande. Deixe o pellet dissolver completamente na água tratada DEPC movendo a ponta da pipeta cima e para baixo várias vezes.
11. Uma vez que o pellet foi dissolvido, colocar a amostra a 55 ° C por 10 minutos.
12. Então, medir a concentração de cada amostra de RNA usando um espectrofotômetro Nanodrop (2 mL da amostra de RNA).
13. Armazenar as amostras de RNA a -80 ° C até à sua utilização.

III. Strand-primeira síntese de cDNA (Como protocolo do fabricante por s usando kit Síntese SuperScript primeira vertente pela Invitrogen).

1. Para cada amostra de RNA adicione o seguinte em um tubo de PCR:

   RNA	mL x
   10mM dNTP mix M	1μl
   Oligo (dt) (0,5 mg / mL)	1 ml
   DEPC água tratada	(8-x) mL
   Volume Total:	10 ml
   Nota: x é o volume de RNA usada para a síntese de cDNA. Dependendo da concentração do RNA, 2-3 mg de RNA serão utilizados para cada reação e do volume total de cada reação deve ser 10 ml.

2. Coloque a mistura de reacção acima em um termociclador a 65 ° C por 4 minutos.
3. Remover os tubos do theromocyler e colocá-los no gelo imediatamente para pelo menos 2 minutos.
4. Prepare a primeira vertente master mix, adicionando o seguinte:

   Tampão RT 10X	2μl
   25mM MgCl 2	4 mL
   0,1 M DTT	2 l
   RNase fora	1 ml

5. Adicionar 9 mL de master mix a cada tubo contendo a amostra de RNA, misturar por pipetagem e centrifugar brevemente a mistura.
6. Coloque os tubos de volta no termociclador e incubar por 2 minutos a 42 ° C.
7. Pause o termociclador e adicionar 1 ml de Sobrescrito II enzima transcriptase reversa (Invitrogen) para cada tubo. Esta etapa deve ser feito rapidamente.
8. Incubar as amostras a 42 ° C por 1,5 horas.
9. Finalizar a reação a 70 ° C por 15 minutos.
10. Remover os tubos do termociclador e colocá-los no gelo.
11. Adicionar 1 ml de RNase H a cada tubo e colocá-los de volta no termociclador a 37 ° C por 20 minutos.
12. Depois de tirar as amostras fora do termociclador, adicionar 20 mL de água livre de nuclease em cada tubo. O volume de cada amostra é dobrado nesta fase.
13. Verificar a concentração de cada amostra usando 2 mL da amostra. Tome alíquota de cada amostra, para fazer a concentração de 20ng/μl para uso em qRT-PCR. A quantidade de água para compensar as amostras a uma concentração de 20ng/μl dependerá da concentração inicial do cDNA sintetizado.

IV. qRT-PCR:

Design de primer e Determinação do gene referência

1. Primers de design com uma temperatura de fusão (Tm) de 60 ° C e um tamanho de produto de ~ 100bp.
2. AP-PERI1 é usado como o gene de interesse para esta experiência. Um gene de referência ou de controle interno é necessária para posterior análise e normalização dos dados. Proteína ribossomal (AP-RP1) é usado como gene de referência para este experimento.
3. Prepare 5um stocks de trabalho dos primers que serão utilizados, incluindo o seu gene de referência.

Elaboração de normas

4. Para calcular a eficiência dos primers sendo usado normas devem ser feitas.
5. Faça uma mistura do cDNA a partir de diferentes amostras que serão testadas.
6. 5X fazer diluições seriadas para cada ponto desejado no gráfico. Quatro diluições devem ser o suficiente, mas cinco são altamente recomendados.
7. O volume vai variar dependendo de quantos pontos e quantos técnicos replica estão sendo usados. Não deve ser suficiente para fazer um padrão para cada gene a ser testado, incluindo o gene de referência.

Template placa

8. Criar um modelo indicando o nome da amostra para cada poço da placa de qRT-PCR. Lembre-se de incluir padrões para cada gene e pelo menos dois técnicos repetições por amostra.

Configurar os parâmetros de ciclismo

9. Ligue a máquina de qRT-PCR e entrar os parâmetros de bicicleta. Os parâmetros de ciclismo para este experimento é a seguinte:
   Passo 1:
   • Um ciclo: 95 min 3 ° C
   Passo 2:
   • 40 ciclos: 95 ° C 15 segundos seguido de 60 ° C 30 segundos
     (Opcional: para determinar a curva de fusão incluir as seguintes etapas)
   Passo 3:
   • Um ciclo: 95 ° C 1 min
   Passo 4:
   • 1cycle: 55 ° C 1 min
   Passo 5:
   • 81 ciclos: 55 ° C 30 segundos

Placa configurada para CFX96 (BioRad) máquina

11. Prepare a mistura de mestre para cada gene (incluindo o gene de referência) em tubo separado. Para cada bem, a mistura principal consiste em

    Água livre de nuclease	2μl
    2.5 X SYBR green	4 mL
    Primer para a frente	1 ml
    Reverse Primer	1 ml
    Volume total	8 mL

12. Durante a preparação do master mix incluem 02/01 reações extra para contabilizar erros de pipetagem.
13. De acordo com o modelo previamente elaborado, adicione 2 mL (20 ng / mL) de cDNA para cada poço. Então, adicionar 8 mL da mistura principal a cada poço, resultando em um volume total de 10 mL por reação.
14. Pipeta cima e para baixo (2-3X) para garantir que a amostra é bem misturado. Verifique se o líquido não permanece na ponta. Para evitar a contaminação cruzada, use uma nova ponta para cada amostra.
15. Uma vez que toda a placa está configurada, cobrir a placa com fita óptica. Evite tocar a fita como a presença de gordura pode afetar a leitura. Em seguida, centrifugar a placa a 500 rpm por 1 minuto para assegurar que todos os produtos nos poços estão na parte inferior da placa.
16. Após centrifugação, verifique se não há gelo ou água no fundo do prato. Finalmente, colocar a placa na máquina qRT-PCR e PCR executar o programa.

V. Representação diagramática do Experimento

Figura 1: Fluxograma representando a ordem seqüencial de etapas para o estudo da expressão gênica.

Figura 2: A) larval dissecção EAB mostrando intestino médio no meio. B) do intestino médio de larvas isoladas EAB

Figura 3: A) A média de valores de expressão relativa (REVs) para um gene peritrophin (AP-PERI1) em diferentes tecidos, incluindo cutícula larval (Cu), intestino (MG) ​​e órgãos de gordura (FB). Uma proteína específica EAB ribossomal (doravante, AP-RP1) foi utilizado como controle interno para normalizar os dados obtidos para o gene de interesse, AP-PERI1. B) Variação relativa dobra de AP-PERI1 em tecidos larval. O tecido cutícula mostrou o menor expressão e, portanto, foi tomado como o calibrador (1X) amostra (Pfaffl, 2001).

Figura 4: A) A média de valores de expressão relativa (REVs) para um gene peritrophin (AP-PERI1) em diferentes estágios de desenvolvimento da EAB incluindo estágios larvais (1, 2, 3 e 4), pré-pupa (PP) e adultos (A). Uma proteína específica EAB ribossomal (AP-RP1) foi utilizado como controle interno para normalizar os dados obtidos para o gene de interesse, AP-PERI1. B) Variação relativa dobra de AP-PERI1 em vários estágios de desenvolvimento. A amostra PP mostrou o menor nível de níveis de mRNA e, portanto, foi tomado como o calibrador (1X amostra).

VI. Conclusão

Quantitativas PCR em tempo real (qRT-PCR) é uma ferramenta eficaz para diagnosticar os níveis de mRNA nos tecidos do inseto e estágios diferentes de desenvolvimento. Além disso, qRT-PCR tem sido principalmente a ferramenta chave para validar os dados gerados a partir de alto rendimento análises de expressão gênica, tais como microarrays ea nova geração de RNA-Seq.

Discussion

Os ciclos de limiar (Ct) valor é obtido para cada amostra na placa de qRT-PCR. Para fazer a curva padrão, o valor de Ct obtidos para cada diluição foi em função do log da sua concentração. Os valores de Ct para as amostras experimentais foram então desenhados para esta curva padrão de diluição em série. Quantidades alvo foram calculados a partir de distintas curvas padrão gerada para cada tecido ou seja, experiência e expressão de desenvolvimento. Os valores de expressão relativa (REVs) foram, então, determinada pela divisão das quantidades da seqüência alvo de interesse (neste caso AP-PERI1) com a quantidade obtida para o controle interno (AP-RP1). Para os cálculos de significância, os registros dos REVs para cada gene foram analisados ​​por ANOVA (Análise de Variância) utilizando o procedimento PROC MIXED do SAS (SAS Institute Inc. Guia SAS / STAT usuário s, Versão 9.1). Significância em nível de expressão foi determinado em p <0,05. Relativa mudanças vezes no caso de tecidos foram calculadas tendo a amostra cutícula como calibrador (1X amostra, Pfaffl, 2001). Portanto, os níveis de expressão nos órgãos do intestino médio e gordura foram em relação à cutícula. No caso da expressão de desenvolvimento, a amostra pré-pupa foi considerado como o calibrador. Para ambos os estudos, dois biológicos repetições e três técnicos repetições foram utilizadas.

Nosso experimento revelou significativa (p <0,05) maiores níveis de transcrição AP-PERI1 no tecido do intestino médio (Fig. 3) em comparação a outros tecidos analisados. Durante o desenvolvimento das etapas de alimentação (ou seja, os estágios larvais e adulto) foram significativamente (p <0,05) maior do que a amostra de pré-pupa (Fig. 4). Os níveis de mRNA, pelo menos foram calculados para cutícula e prepupas (Figs. 3 e 4). Dado que peritrophins são parte integrante do intestino médio de insetos nossos resultados corroboram os achados anteriores em outras espécies de insetos (Mittapalli et al. 2007). Os padrões observados durante as fases de desenvolvimento confirmar ainda mais a função de AP-per1 na digestão e processos relacionados. O amplamente utilizado Bacillus thuringiensis (Bt) toxinas em plantas cultivadas na verdade alvo e perturbar a PM em insetos (Pauchet et al., 2009). Assim, os resultados obtidos neste estudo pode não só revelar alvos potenciais para o controle EAB, mas também fornecer conhecimentos fundamentais sobre a forma como espécies de insetos se adaptar aos novos ambientes.