Summary
Dit artikel beschrijft een procedure voor de inductie van orthotope bioluminescente levertumoren bij muizen, en daaropvolgende analyse van groei van de tumor beperkt tot de lever met behulp van live-hele lichaam luminescentie beeldvorming.
Abstract
Deze video beschrijft de oprichting van levermetastasen in een muismodel die vervolgens kunnen worden geanalyseerd door bioluminescente beeldvorming. Tumor-cellen zijn specifiek toegediend aan de lever om een gelokaliseerde tumor lever veroorzaken, via mobilisatie van de milt en splitsen in twee, waardoor intact de vasculaire pedikel voor elk de helft van de milt. Lewis longcarcinoom cellen die constitutief uitdrukken van de vuurvlieg luciferase gen (luc1) zijn geënt in een hemi-milt, die vervolgens wordt 10 minuten later gereseceerd. De andere hemi-milt is intact gelaten en keerde terug naar de buik. Lever groei van de tumor kan worden gecontroleerd door bioluminescentie beeldvorming met behulp van de IVIS hele lichaam imaging-systeem. Kwantitatieve beeldvorming van de groei van tumoren met behulp van IVIS zorgt voor een nauwkeurige kwantificering van levensvatbare tumorcellen. Tumor celdood en necrose als gevolg van medicamenteuze behandeling is vroeg aangegeven door een vermindering van de lichtgevende signaal. Deze muis model maakt voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan uitgezaaide tumor-cel overleving en de groei en kan worden gebruikt voor de evaluatie van therapeutica van levermetastasen.
Protocol
Introductie
De lever is vaak de eerste plaats van gemetastaseerde ziekte en kan de enige site van verspreiding in maar liefst 30 40% van de patiënten met gevorderde ziekte. Maar opties voor de behandeling van gemetastaseerde levertumoren zijn maar weinig met een minderheid van de patiënten die geschikt zijn voor resectie en slechts 23% de belangrijkste responders aan chemotherapeutica. Preklinische onderzoek op dit gebied is beperkt door de afwezigheid van een geschikte muis model om geïsoleerde lever-ziekte te bestuderen. Beschrijven we een split-milt benadering die kan worden gebruikt om op betrouwbare wijze een uniforme, diffuse levermetastasen. Resectie van deze helft van de milt voorkomt de gevolgen van de milt tumorgroei en de andere helft van de milt is terug met een intacte portale circulatie naar milt immuun beschermende eigenschappen behouden. Het model dat we beschrijven is vrij eenvoudig uit te voeren en kan snel worden gedaan door middel van een enkele incisie. De bioluminescente eigenschappen van de tumor-cellijn maakt nauwkeurige kwantificering van de respons op de behandeling, zonder opoffering van de dieren.
Protocol
I. celpreparaat
- Lewis longcarcinoom cellen worden gekweekt Modified Essential Dulbecco's medium aangevuld met 10% foetaal kalf serum bij 37 ° C, 5% CO 2 en geoogst door trypsinisation bij de sub-samenvloeiend.
- Cellen werden geteld met behulp van een Nucleocounter (Chemo-Metec, Denemarken) en een enkele celsuspensie van 1 X 10 6 cellen in 200 ui werd voorbereid in serum vrije media.
II. Muis Voorbereiding
Opmerking: Alle procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van het University College Cork. In ons laboratorium hebben we gebruik van injecteerbare anesthetica om de muis te verdoven, als alternatief, kan men gebruiken inhalatie anesthetica om hetzelfde effect te bereiken. De muis stam we gebruikten is de haarloze MF1 nu / nu stam verkregen van Harlan Laboratories (Oxfordshire, Engeland). Vrouw MF1 nu / nu muizen met een gewicht 16 tot 22 g en van 6-8 weken oud werden opgenomen in dit experiment. Andere stammen, zoals de C57 en Balb / c kan ook gebruikt worden met de juiste tumorcellijnen.
- Anesthesie werd geleverd door intraperitoneale injectie van 100ul van 1,5 mg ketamine en 300 ug xylazine.
- De diepte van de anesthesie wordt beoordeeld op basis teen knijpen. Er mag geen terugtrekking reflex met teen knijpen worden.
- De verdoofde muis is goed gepositioneerd en geplakt over een verwarmings-pad.
- De buik is voorbereid met een 10% Betadine-oplossing.
- De buik en chirurgische site zijn gedrapeerd in een steriele manier.
III. Abdominale incisie
- Een kleine subcostal incisie gemaakt in de huid.
- De incisie wordt uitgebreid tot 2-3 cm.
- De buikwand musculatuur werden verdeeld en de buikholte ingevoerd.
IV. Blootstelling en de afdeling van Milt
- De milt is gemobiliseerd en voorzichtig exteriorized op een pre-cut steriel gaasje.
- Twee 4-0 Vicryl ligaturen zijn gebonden rond het midden van de body van de milt.
- Milt is verdeeld tussen de twee ligaturen het creëren van twee hemi-milt.
V. Injectie van cellen in de Hemi-milt
- A 27 G wordt gebruikt om een 100 ul volume van de cellen te injecteren in een hemi-milt.
- Tumor cellen mogen naar de lever afvoer voor tien minuten met voldoende tijd voor het grootste deel van de geïnjecteerde cellen om de lever te bereiken.
VI. Excisie van Hemi-milt, Abdominale sluiting en herstel
- De geïnjecteerde hemi-milt is weggesneden.
- De andere hemi-milt is terug naar de buikholte.
- De spierlaag is gesloten met 4-0 PDS hechting met behulp van een eenvoudige rijgsteek.
- De buikhuid wordt afgesloten met 4-0 Prolene gebruik van onderbroken steken.
- Fluid bolus wordt toegediend en post-operatieve analgesie, Carpofen (5 mg / kg) wordt toegediend door IP injectie gedurende 24 uur na de operatie.
- De muis is toegestaan om te herstellen van narcose
VII. IVIS Whole Body Imaging Bioluminescent
- Muis is verdoofd met behulp van injecteerbare verdoving.
- Luciferine substraat wordt gegeven door intraperitoneale injectie tien minuten voor de beeldvorming
- Muizen worden geplaatst op het podium en verbeelde gedurende 3 minuten met behulp van IVIS Gehele lichaam imaging-systeem
- Luminescentie van de lever kan worden gemeten met behulp van een regio van belang gereedschap
VIII. Blootstelling van muizenlever
- Muis is verdoofd met behulp van injecteerbare verdoving.
- Een incisie in de buik op het dak maakt visualisatie van diffuse levermetastasen in vivo.
- De muis is gedood door cervicale dislocatie en de lever kan worden uitgesneden voor verdere analyse.
_upload/1977/1977fig1.jpg "alt =" Afbeelding 1 "/>
Figuur 1. Gekloneerde muriene onbehandeld en tumor-geïnfiltreerd levers.
Figuur 2. Kinetiek van de lever tumorgroei, zoals blijkt uit IVIS het gehele lichaam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van betrouwbare in vivo modellen voor de studie van de lever metastase wordt steeds steeds belangrijker met de komst van nieuwe therapeutische strategieën. Voor de nauwkeurige studie van nieuwe strategieën, diermodellen moeten relatief gemakkelijk uit te voeren, vormen een aanzienlijk aantal van de metastase, omvatten alle stappen van de metastatische cascade en hebben een verslaggever systeem dat de detectie en telling van een beperkt aantal metastatische cellen mogelijk maakt. De split-milt aanpak, zoals beschreven gaat om een operatie en is een relatief eenvoudige techniek te leren om een uniforme diffuse levermetastasen vast te stellen met een zeer laag risico van carcinomatosa en vena porta trombose 1. De verdeling van de milt in twee hemi-milt kan de injectie van tumorcellen in een hemi-milt. Tumor cellen binnen de portale circulatie en reizen naar de lever, het nabootsen van de eerste stap van de metastatische cascade. Excisie van de geïnjecteerde hemi-milt voorkomt de groei van een milt tumor en de terugkeer van de andere hemi-milt zorgt voor het behoud van de milt immunologische eigenschappen die het dier had voorafgaand aan de procedure .. Dit model kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan typen tumoren. De Lewis long luciferase cellijn kan de lichtgevende kwantificering van een leveraandoening in de tijd. De verbeterde gevoeligheid van de bioluminescentie systeem maakt het mogelijk de detectie en kwantificering van een klein aantal van metastatische cellen. Dit maakt nauwkeurige timing voor de aanvang van de behandeling protocollen en maakt kwantificering van de leverziekte, zonder opoffering van het dier. De eenvoud, duurzaamheid en reproduceerbaarheid maken dit model geschikt is voor de studie van verschillende therapeutische strategieën met inbegrip van nieuwe chemotherapeutica 2, 3 gentherapie en immunotherapie 1,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Cork South Ziekenhuis Victoria University Hospital Borst fonds, de Ierse Cancer Society (CRI07TAN) en de Cork Cancer Research Centre. Lewis long cellijn stabiel tot expressie luciferase was een vriendelijke gift van Dr Karin Jooss, Cell Genesys, Inc, San Francisco, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ketamine | Vétoquinol | ||
| Xylazine | Vétoquinol | ||
| Carprofen | Vétoquinol | ||
| Videne | Ecolab | ||
| Vicryl 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| PDS 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Prolene 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc |
References
- Kasuya, H. Mouse models of subcutaneous spleen reservoir for multiple portal venous injections to treat liver malignancies. Cancer Res. 65, 3823-3827 (2005).
- Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic. World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).
- Li, Z. Y., Ni, S., Yang, X., Kiviat, N., Lieber, A. Xenograft models for liver metastasis: Relationship between tumor morphology and adenovirus vector transduction. Mol Ther. 9, 650-657 (2004).
- Cashman, J. P. Immune gene therapy as a neoadjuvant to surgical excision to control metastatic cancers. Cancer Lett. , (2008).
