Summary
توضح هذه المقالة إجراء لتحريض مثلي bioluminescent أورام الكبد في الفئران ، وتحليل لاحقة من نمو الورم محصورا في الكبد باستخدام يعيش التلألؤ الجسم كله التصوير.
Abstract
هذا الفيديو يصف إنشاء الانبثاث الكبد في نموذج الفأر التي يمكن تحليلها لاحقا من قبل bioluminescent التصوير. تدار خلايا الورم على وجه التحديد إلى الكبد للحث على وجود ورم في الكبد المترجمة ، عن طريق تعبئة والطحال وتقسيمه الى قسمين ، وترك الحبل على الغارب في الأوعية الدموية عنيق لكل نصف الطحال. يتم تلقيح خلايا سرطان الرئة لويس التي تعبر عن هذا الجين constitutively luciferase يراعة (luc1) إلى واحد نصفي الطحال وهي مقطوعة ثم 10 دقيقة في وقت لاحق. ويترك الآخر نصفي الطحال سليمة ، وعاد إلى البطن. ويمكن رصد نمو الورم في الكبد بواسطة التصوير تلألؤ بيولوجي باستخدام التصوير IVIS نظام الجسم كله. التصوير الكمي لنمو الورم باستخدام IVIS يوفر الكميات الدقيقة من الخلايا السرطانية قابلة للحياة. يشار إلى موت الخلايا والأورام نخر بسبب العلاج من تعاطي المخدرات في وقت مبكر عن طريق تخفيض في إشارة bioluminescent. هذا النموذج يسمح الماوس عن التحقيق في الآليات الكامنة الورم النقيلي خلايا البقاء والنمو ، ويمكن استخدامها لتقييم علاجات من ورم خبيث في الكبد.
Protocol
مقدمة
الكبد وغالبا ما يكون أول موقع من المرض المنتشر ، وربما يكون الموقع الوحيد للانتشار في ما يصل الى 30 40 ٪ من المرضى الذين يعانون من المرض المتقدمة. لكن الخيارات المتاحة لعلاج أورام الكبد المنتشر قليلة مع أقلية من المرضى مناسبة لاستئصال وفقط 23 ٪ من المستجيبين الرئيسية مبحث المعالجة الكيميائية. وقد اقتصرت البحوث قبل السريرية في هذا المجال بسبب عدم وجود نموذج الفأر مناسبة لدراسة أمراض الكبد معزولة. وصفنا نهج تقسيم الطحال التي يمكن استخدامها لإنشاء موثوق موحدة ، الانبثاث الكبد انتشارا. استئصال نصف هذا الطحال يتجنب العواقب المترتبة على نمو الورم الطحال ، وعاد والنصف الآخر في الطحال مع تداول بوابة سليمة للحفاظ على خصائص وقائية مناعية الطحال. والنموذج الذي وصف بسيط للغاية لتنفيذ ويمكن القيام به بسرعة من خلال شق واحد. خصائص bioluminescent الورم خط الخلية يسمح الكمي الدقيق للالاستجابة للعلاج من دون تضحية من الحيوانات.
بروتوكول
أولا تحضير خلية
- تزرع خلايا سرطان الرئة متوسطة لويس Dulbecco من الضروري تعديل تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 وتحصد trypsinisation عندما شبه متموجة.
- احصي الخلايا باستخدام Nucleocounter (الكيماوي metec ، الدنمارك) وتعليق خلية واحدة من الخلايا 1 X 6 10 في 200 ميكرولتر أعدت في وسائل الإعلام الحرة المصل.
II. إعداد الماوس
ملاحظة : تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاق من جامعة كوليدج كورك. في مختبرنا نستخدم حقن التخدير لتخدير الماوس ، بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أن استخدام المسكنات استنشاقه لتحقيق التأثير نفسه. سلالة الماوس كنا هو أصلع MF1 نو / نو سلالة تم الحصول عليها من مختبرات هارلان (أوكسفوردشاير ، انكلترا). شملت الإناث MF1 نو / نو الفئران وزنها 16-22 غ و6-8 أسابيع من العمر في هذه التجربة. ويمكن أيضا سلالات أخرى مثل C57 وBALB / ج مناسبة يمكن استخدامها مع خطوط الخلايا السرطانية.
- وتم تسليم التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين 100ul 1.5 ملغ و 300 ميكروغرام زيلازين.
- ويتم تقييم عمق التخدير باستخدام قرصة أخمص قدميه. وينبغي أن يكون هناك منعكس الانسحاب مع قرصة أخمص قدميه.
- يتوضع بشكل صحيح الماوس تخدير ، وسجلت أكثر من وسادة التدفئة.
- وهيأهم البطن بمحلول betadine 10 ٪.
- ورايات البطن وموقع الجراحة بطريقة عقيمة.
III. شق البطن
- يتم إجراء شق صغير في الجلد تحت الضلع.
- ويمتد الشق إلى 2-3 سم.
- تم تقسيم عضلات البطن الجدار ودخلت التجويف البريتوني.
رابعا. وتعرض شعبة الطحال
- وحشدت الطحال وexteriorized بلطف على شاش معقم قبل قطع.
- وترتبط اثنين من الحروف المركبة vicryl 4-0 في جميع أنحاء الجسم منتصف الطحال.
- وينقسم الطحال بين الحروف المركبة two two خلق نصفي الطحال.
خامسا حقن الخلايا في نصفي الطحال
- وتستخدم مجموعة من 27 إلى 100 وحدة ضخ ميكرولتر من الخلايا في واحد نصفي الطحال.
- ويسمح للخلايا الأورام لنزيف في الكبد لمدة عشر دقائق وقتا كافيا لتوفير غالبية حقن الخلايا للوصول إلى الكبد.
سادسا. استئصال الطحال ، هيمي ، وإغلاق البطن والاسترداد
- يستأصل فيه حقن نصفي الطحال.
- عاد هو الآخر نصفي الطحال إلى تجويف البطن.
- إغلاق طبقة العضلات مع خياطة PDS 4-0 باستخدام غرزة بسيطة التشغيل.
- إغلاق جلد البطن مع Prolene 4-0 باستخدام غرز توقف.
- يدار بلعة السوائل وإدارة ما بعد الجراحة للوعي ، Carpofen (5 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن في مجال الملكية الفكرية لمدة 24 ساعة بعد الجراحة.
- ولا يسمح للماوس على التعافي من التخدير
سابعا. IVIS كامل الجسم Bioluminescent التصوير
- الفأر هو تخدير باستخدام حقن مخدر.
- وتعطى Luciferin الركيزة التي داخل الصفاق عشر دقائق قبل الحقن التصوير
- وضعت الفئران على المسرح وتصوير لمدة 3 دقائق باستخدام IVIS تصوير الجسم نظام الجامعة
- ويمكن قياس التلألؤ من الكبد باستخدام أداة منطقة الفائدة
ثامنا. التعرض للكبد الفأر
- الفأر هو تخدير باستخدام حقن مخدر.
- هناك شق في البطن على السطح يسمح التصور من ورم خبيث في الكبد المنتشر في الجسم الحي.
- هو الموت الرحيم الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم ، ويمكن استئصاله الكبد لإجراء مزيد من التحليل.
_upload/1977/1977fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/>
الشكل 1. علاج الفئران يستأصل الورم طازجة وتسللت - الأكباد.
الشكل 2. حركية نمو الورم الكبدي كما يتضح من التصوير IVIS الجسم كله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وضع موثوق بها في النماذج الحية لدراسة الكبد الانبثاث أصبحت متزايدة الأهمية مع ظهور استراتيجيات علاجية جديدة. لدراسة دقيقة لوضع استراتيجيات جديدة ونماذج حيوانية ينبغي أن يكون من السهل نسبيا على أداء وشكل عددا كبيرا من ورم خبيث ، وإشراك جميع الخطوات من تتالي النقيلي وجود نظام يسمح للكشف مراسل والفرز لعدد محدود من الخلايا المتنقل. نهج تقسيم الطحال صفها بأنها تنطوي على عملية واحدة ، وهي تقنية سهلة نسبيا للتعلم لإقامة موحدة الانبثاث الكبد منتشر مع مخاطر منخفضة جدا من سرطاني وبوابة خثار الأوردة 1. تقسيم الطحال الى قسمين نصفي الطحال السماح للحقن الخلايا السرطانية في أحد نصفي الطحال. خلايا الأورام دخول بوابة تداول والسفر إلى الكبد ، ومحاكاة الخطوة الأولى من سلسلة النقيلي. استئصال الطحال ، نصفي حقن يتجنب نمو ورم الطحال وعودة الطحال - نصفي الآخر يضمن الاحتفاظ خصائص مناعية الطحال الذي كان الحيوان قبل الإجراء.. يمكن استخدام هذا النموذج لمجموعة متنوعة من أنواع الأورام. لويس luciferase الرئة خط الخلية يسمح الكمي bioluminescent من مرض في الكبد مع مرور الوقت. حساسية محسنة من نظام يسمح للتلألؤ بيولوجي الكشف النوعي والكمي لعدد صغير من الخلايا المتنقل. وهذا يسمح توقيت دقيق للشروع في بروتوكولات العلاج الكمي وتمكن من مرض في الكبد دون التضحية من الحيوان. البساطة والمتانة وجعل هذه استنساخ نموذج مناسب لدراسة استراتيجيات العلاج مبحث المعالجة الكيميائية المختلفة بما في ذلك الرواية 2 و 3 و العلاج الجيني 1،4 المناعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من خلال صندوق كورك جنوب مستشفى جامعة فيكتوريا في مستشفى الثدي ، وجمعية السرطان الأيرلندية (CRI07TAN) ومركز أبحاث السرطان كورك. وكان لويس خط الخلية الرئة معربا عن ستابلي luciferase هدية عينية من الدكتورة كارين Jooss ، خلية جينيسيس ، وشركة ، سان فرانسيسكو ، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ketamine | Vétoquinol | ||
| Xylazine | Vétoquinol | ||
| Carprofen | Vétoquinol | ||
| Videne | Ecolab | ||
| Vicryl 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| PDS 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Prolene 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc |
References
- Kasuya, H. Mouse models of subcutaneous spleen reservoir for multiple portal venous injections to treat liver malignancies. Cancer Res. 65, 3823-3827 (2005).
- Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic. World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).
- Li, Z. Y., Ni, S., Yang, X., Kiviat, N., Lieber, A. Xenograft models for liver metastasis: Relationship between tumor morphology and adenovirus vector transduction. Mol Ther. 9, 650-657 (2004).
- Cashman, J. P. Immune gene therapy as a neoadjuvant to surgical excision to control metastatic cancers. Cancer Lett. , (2008).
