Modèle murin Bioluminescent tumeurs hépatiques

Summary

Cet article décrit une procédure pour l'induction de tumeurs du foie orthotopique chez des souris bioluminescentes, et l'analyse ultérieure de la croissance tumorale limitées au foie en utilisant l'imagerie en direct toute la luminescence du corps.

Abstract

Cette vidéo décrit l'établissement de métastases hépatiques dans un modèle de souris qui peut ensuite être analysé par imagerie par bioluminescence. Les cellules tumorales sont administrés spécifiquement dans le foie pour induire une tumeur hépatique localisée, via la mobilisation de la rate et le fractionnement en deux, laissant intact le pédicule vasculaire pour chaque moitié de la rate. Cellules de carcinome pulmonaire de Lewis qui expriment constitutivement le gène luciférase de luciole (luc1) sont inoculées dans un hémi-rate qui est ensuite réséqué 10 minutes plus tard. L'autre hémi-rate est laissé intact et est retourné à l'abdomen. La croissance des tumeurs du foie peuvent être surveillés par imagerie par bioluminescence en utilisant l'imagerie IVIS ensemble du système du corps. Imagerie quantitative de la croissance tumorale en utilisant IVIS fournit une quantification précise des cellules tumorales viables. La mort des cellules tumorales et la nécrose due à un traitement médicamenteux est indiqué au début par une réduction dans le signal de bioluminescence. Ce modèle de souris permet d'étudier les mécanismes sous-jacents métastatique des tumeurs cellule de survie et de croissance et peut être utilisé pour l'évaluation des traitements des métastases hépatiques.

Protocol

Présentation

Le foie est souvent le premier site de la maladie métastatique et peut être le seul site de dissémination dans autant que 30 à 40% des patients ayant une maladie avancée. Toutefois les options pour traiter des tumeurs hépatiques métastatiques sont rares avec une minorité de patients appropriés pour la résection et seulement 23% des intervenants majeurs aux agents chimiothérapeutiques. La recherche préclinique dans ce domaine ont été limitées par l'absence d'un modèle de souris adaptée à l'étude des maladies hépatiques isolées. Nous décrivons une approche split-rate qui peuvent être utilisées pour déterminer de manière sûre uniforme, métastases hépatiques diffuses. La résection de cette moitié de la rate permet d'éviter les conséquences de la croissance tumorale de la rate et l'autre moitié de la rate est retourné avec une circulation portale intacte pour maintenir spléniques immunitaires protectrices. Le modèle que nous décrivons est assez simple à réaliser et qui peut être fait rapidement par une seule incision. Les propriétés bioluminescentes de la lignée cellulaire tumorale permet une quantification précise de la réponse au traitement, sans sacrifice d'animaux.

Protocole

Préparation des cellules I.

1. Cellules de carcinome pulmonaire de Lewis sont cultivés Dulbecco milieu modifié essentielles complétée par du sérum de veau foetal à 10% à 37 ° C, 5% de CO ₂ et récoltées par trypsinisation lorsque les sous-confluentes.
2. Les cellules ont été comptées en utilisant un NucleoCounter (chimio-metec, Danemark) et une suspension cellulaire unique de 1 x 10 ⁶ cellules dans 200 ul a été préparé dans le sérum des médias libres.

II. Préparation de la souris

Note: Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université de Cork. Dans notre laboratoire, nous utilisons des anesthésiques injectables pour anesthésier la souris, ou alternativement, on peut utiliser des anesthésiques inhalés pour atteindre le même effet. La souche de souris, nous avons utilisé est le poil MF1 nu / nu souche obtenue à partir Harlan Laboratories (Oxfordshire, Angleterre). Femme MF1 souris nu / nu pesant de 16 à 22 g et de 6-8 semaines d'âge ont été inclus dans cette expérience. D'autres souches comme le C57 et Balb / c peuvent également être utilisés avec les lignées cellulaires tumorales.

1. L'anesthésie a été administré par injection intrapéritonéale de 100 ul de 1,5 mg de kétamine et de xylazine 300 ug.
2. La profondeur de l'anesthésie est évaluée à l'aide pincement de l'orteil. Il devrait y avoir aucun réflexe de retrait avec pincement de l'orteil.
3. La souris est positionné correctement anesthésiés et enregistrée sur un coussin chauffant.
4. L'abdomen est préparée avec une solution bétadine à 10%.
5. L'abdomen et du site opératoire sont drapées d'une manière stérile.

III. Incision abdominale

1. Une petite incision sous-costale est faite dans la peau.
2. L'incision est étendue à 2-3 cm.
3. La musculature de la paroi abdominale ont été divisés et la cavité péritonéale est entré.

IV. L'exposition et la Division de la rate

1. La rate est mobilisé et doucement extériorisé sur une gaze stérile, pré-coupés.
2. Deux 4-0 ligatures vicryl sont attachés autour du corps mi de la rate.
3. Spleen est divisé entre les deux ligatures la création de deux hémi-rate.

Injection V. de cellules dans le Hemi-rate

1. Un G 27 est utilisée pour injecter un volume de 100 ul de cellules dans un hémi-rate.
2. Les cellules tumorales sont autorisés à drainer le foie pendant dix minutes fournissant suffisamment de temps pour la majorité des cellules injectées pour atteindre le foie.

VI. Excision de Hemi-rate, la fermeture abdominale et de récupération

1. L'injection de l'hémi-rate est excisée.
2. L'autre hémi-rate est retourné à la cavité abdominale.
3. La couche musculaire est fermé par suture de PDS 4-0 en utilisant un simple point en marche.
4. La peau abdominale est fermée avec Prolène 4-0 points de suture à l'aide interrompue.
5. Fluide bolus est administré et l'analgésie postopératoire, Carpofen (5 mg / kg) est administré par injection IP pendant 24 heures après la chirurgie.
6. La souris est autorisé à remettre de l'anesthésie

VII. IVIS corps entier Bioluminescent Imaging

1. La souris est anesthésiée à l'aide anesthésique injectable.
2. Substrat luciférine est donnée par injection intra-péritonéale dix minutes avant l'imagerie
3. Les souris sont placées sur la scène et imagé pour 3 min à l'aide du système IVIS imagerie du corps entier
4. Luminescence du foie peut être mesurée en utilisant une région d'un outil d'intérêt

VIII. L'exposition de foie de souris

1. La souris est anesthésiée à l'aide anesthésique injectable.
2. Une incision abdominale sur le toit permet la visualisation des métastases hépatiques diffuses in vivo.
3. La souris est euthanasié par dislocation cervicale et le foie peut être excisée pour une analyse ultérieure.

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Figure 1. Fraîchement excisés traités murines et tumorales infiltrées foies.

Figure 2. Cinétique de croissance de la tumeur hépatique comme en témoigne l'imagerie IVIS corps tout entier.

Discussion

Le développement de la fiabilité des modèles in vivo pour l'étude des métastases hépatiques est de plus en plus important avec l'avènement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour l'étude précise de nouvelles stratégies, des modèles animaux devrait être relativement facile à réaliser, forment un nombre significatif de métastases, impliquer toutes les étapes de la cascade métastatique et ont un système rapporteur qui permet la détection et le comptage d'un nombre limité de cellules métastatiques. L'approche split-rate comme décrit implique une opération unique et est une technique relativement facile à apprendre pour établir uniformes métastases hépatiques diffuses avec un très faible risque de carcinose et la thrombose veineuse portail ^1. La division de la rate en deux hémi-rate permettre l'injection de cellules tumorales dans un hémi-rate. Les cellules tumorales dans la circulation portale et de voyage vers le foie, imitant la première étape de la cascade métastatique. L'excision de la injectés hémi-rate évite la croissance d'une tumeur splénique et le retour de l'autre hémi-rate assure le maintien des propriétés immunologiques qui rate l'animal avait avant la procédure .. Ce modèle peut être utilisé pour une variété de types de tumeurs. Le poumon de Lewis luciférase lignée cellulaire permet la quantification bioluminescents de maladie du foie au cours du temps. La sensibilité accrue du système de bioluminescence permet la détection et la quantification d'un petit nombre de cellules métastatiques. Ceci permet une synchronisation précise de l'initiation de protocoles de traitement et permet la quantification de maladie du foie, sans sacrifice de l'animal. La simplicité, la durabilité et la reproductibilité font de ce modèle approprié pour l'étude des différentes stratégies thérapeutiques, y compris de nouveaux agents chimiothérapeutiques ^2, la thérapie génique ³ et ^1,4 immunothérapie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ketamine	Vétoquinol
Xylazine	Vétoquinol
Carprofen	Vétoquinol
Videne	Ecolab
Vicryl 4-0 suture	Ethicon Inc.
PDS 4-0 suture	Ethicon Inc.
Prolene 4-0 suture	Ethicon Inc.
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc