Summary
इस लेख orthotopic चूहों में bioluminescent जिगर ट्यूमर के शामिल है, और जीना पूरे शरीर luminescence इमेजिंग का उपयोग जिगर तक ही सीमित ट्यूमर वृद्धि के बाद विश्लेषण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है.
Abstract
यह वीडियो एक माउस मॉडल है कि बाद में bioluminescent इमेजिंग द्वारा विश्लेषण किया जा सकता में जिगर metastases की स्थापना का वर्णन करता है. ट्यूमर कोशिकाओं को विशेष रूप से जिगर के लिए एक स्थानीयकृत जिगर ट्यूमर प्रेरित करने के लिए प्रशासित रहे हैं, प्लीहा और बंटवारे की लामबंदी के माध्यम से दो में, तिल्ली के प्रत्येक आधे के लिए डंडी बरकरार संवहनी छोड़ने. लुईस फेफड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं है कि constitutively जुगनू luciferase जीन (luc1) व्यक्त एक Hemi तिल्ली जो तब 10 मिनट बाद resected है में inoculated हैं. अन्य Hemi - तिल्ली बरकरार रह गया है और पेट को लौट गया. जिगर ट्यूमर के विकास bioluminescence IVIS पूरे शरीर इमेजिंग प्रणाली का उपयोग इमेजिंग द्वारा नजर रखी जा सकती है. ट्यूमर के विकास की मात्रात्मक इमेजिंग IVIS का उपयोग व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं के सटीक quantitation प्रदान करता है. ट्यूमर कोशिका मृत्यु और नशीली दवाओं के उपचार के लिए कारण परिगलन जल्दी bioluminescent संकेत में कमी से संकेत दिया है. इस माउस मॉडल metastatic ट्यूमर सेल अस्तित्व और विकास के अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए अनुमति देता है और यकृत मेटास्टेसिस के चिकित्सा विज्ञान के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
परिचय
जिगर अक्सर metastatic रोग की पहली साइट है और उन्नत बीमारी के साथ रोगियों के रूप में कई के रूप में 30 के रूप में 40% में प्रसार के केवल साइट हो सकता है. हालांकि metastatic जिगर ट्यूमर के इलाज के लिए विकल्प लकीर लिए उपयुक्त रोगियों के एक अल्पसंख्यक के साथ कुछ कर रहे हैं और केवल 23% chemotherapeutics के लिए प्रमुख responders. इस क्षेत्र में Preclinical अनुसंधान पृथक जिगर की बीमारी का अध्ययन एक उपयुक्त माउस मॉडल के अभाव के द्वारा सीमित किया गया है. हम कि मज़बूती वर्दी, फैलाना जिगर metastases स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक विभाजन तिल्ली दृष्टिकोण का वर्णन. तिल्ली के इस आधे के लकीर प्लीहा - संबंधी ट्यूमर के विकास और तिल्ली के दूसरे आधे एक अक्षुण्ण पोर्टल प्लीहा - संबंधी प्रतिरक्षा सुरक्षात्मक गुणों को बनाए रखने के संचलन के साथ वापस आ रहा है के परिणामों से बचा जाता है. मॉडल हम वर्णन प्रदर्शन करने के लिए काफी सरल है और जल्दी से एक एकल चीरा के माध्यम से किया जा सकता है. ट्यूमर कोशिका लाइन के bioluminescent गुणों पशुओं के बलिदान के बिना उपचार की प्रतिक्रिया की सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है.
प्रोटोकॉल
I. सेल तैयार
- लुईस फेफड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं Dulbecco संशोधित आवश्यक 37 पर 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक मध्यम ° सी, 5% सीओ 2 बड़े हो रहे हैं और जब उप - मिला हुआ trypsinisation द्वारा काटा .
- कक्ष (Chemo - metec, डेनमार्क) Nucleocounter और 1 एक्स 10 200 μl में 6 कोशिकाओं की एक एकल कक्ष निलंबन सीरम मुक्त मीडिया में तैयार किया गया था का उपयोग कर गिना रहे थे.
द्वितीय. माउस तैयार
नोट: सभी प्रक्रियाओं के यूनिवर्सिटी कॉलेज कॉर्क की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. हमारी प्रयोगशाला में हम इंजेक्शन anesthetics का उपयोग करने के लिए माउस anesthetize, वैकल्पिक रूप से, एक साँस anesthetics का उपयोग करने के लिए एक ही प्रभाव को प्राप्त कर सकते हैं. हम इस्तेमाल माउस तनाव गंजा MF1 / परमाणु परमाणु Harlan लेबोरेटरीज (Oxfordshire, इंग्लैंड) से प्राप्त तनाव है. स्त्री MF1 / परमाणु परमाणु चूहों वजन 16-22 ग्राम और उम्र के 6-8 हफ्तों के इस प्रयोग में शामिल थे. C57 और / Balb ग जैसे अन्य उपभेदों भी उपयुक्त ट्यूमर सेल लाइनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
- अनेस्थेसिया 100ul 1.5 मिलीग्राम ketamine और 300 स्नातकीय xylazine intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा दिया गया था.
- संज्ञाहरण की गहराई पैर के अंगूठे चुटकी का उपयोग मूल्यांकन किया है. पैर के अंगूठे चुटकी के साथ कोई वापसी पलटा जाना चाहिए.
- anesthetized माउस ठीक से तैनात है और एक हीटिंग पैड पर टेप.
- पेट के एक 10% betadine समाधान के साथ तैयार है.
- पेट और शल्य साइट एक बाँझ फैशन में लिपटी हैं.
III. पेट चीरा
- एक छोटे subcostal चीरा त्वचा में किया जाता है.
- चीरा 2-3 सेमी करने के लिए बढ़ाया है.
- पेट की दीवार मांसलता विभाजित थे और peritoneal गुहा में प्रवेश किया.
चतुर्थ. एक्सपोजर और प्लीहा की डिवीजन
- तिल्ली जुटाए और एक पूर्व में कटौती बाँझ धुंध पर धीरे exteriorized.
- दो 4-0 vicryl ligatures तिल्ली के मध्य शरीर के आसपास बंधे हैं.
- प्लीहा दो ligatures बनाने Hemi - spleens दो के बीच विभाजित है.
Hemi - तिल्ली में वी. प्रकोष्ठों के इंजेक्शन
- एक 27 जी के लिए एक Hemi - तिल्ली में कक्षों की एक 100 μL मात्रा इंजेक्षन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- ट्यूमर कोशिकाओं दस मिनट इंजेक्शन कोशिकाओं के बहुमत के लिए जिगर तक पहुँचने के लिए पर्याप्त समय उपलब्ध कराने के लिए जिगर के लिए पलायन करने के लिए अनुमति दी जाती है.
छठी. छांटना Hemi तिल्ली, उदर बंद करने और रिकवरी
- इंजेक्शन HEMI तिल्ली excised है.
- अन्य Hemi - तिल्ली उदर गुहा के लिए वापस आ रहा है.
- मांसपेशी परत 4-0 पीडीएस सीवन का उपयोग कर एक सरल चल रहे सिलाई के साथ बंद कर दिया है.
- पेट की त्वचा 4-0 बाधित टांके का उपयोग कर Prolene के साथ बंद कर दिया है.
- द्रव सांस दिलाई है और पोस्ट ऑपरेटिव analgesia, Carpofen (5 मिग्रा / किग्रा) आईपी इंजेक्शन द्वारा 24 घंटे के बाद सर्जरी के लिए प्रशासित किया जाता है.
- माउस संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति दी गई है
सातवीं. IVIS पूरे शरीर bioluminescent इमेजिंग
- माउस का उपयोग anesthetized इंजेक्शन चतनाशून्य करनेवाली औषधि है.
- Luciferin सब्सट्रेट इमेजिंग पहले अंतर peritoneal इंजेक्शन दस मिनट के द्वारा दिया जाता है
- चूहे मंच पर रखा जाता है और 3 मिनट के लिए imaged IVIS पूरे शरीर इमेजिंग प्रणाली का उपयोग
- जिगर से luminescence ब्याज उपकरण के एक क्षेत्र का उपयोग कर मापा जा सकता है है
आठवीं. माउस जिगर का एक्सपोजर
- माउस का उपयोग anesthetized इंजेक्शन चतनाशून्य करनेवाली औषधि है.
- एक छत पेट चीरा vivo में फैलाना यकृत मेटास्टेसिस के दृश्य की अनुमति देता है.
- माउस गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से euthanized है और जिगर आगे के विश्लेषण के लिए excised हो सकता है.
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चित्रा 1. हौसले excised murine अनुपचारित और ट्यूमर में घुसपैठ की यकृत.
चित्रा 2 यकृत ट्यूमर IVIS पूरे शरीर इमेजिंग द्वारा evidenced के रूप में वृद्धि के कैनेटीक्स.
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Discussion
यकृत मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए vivo मॉडल में विश्वसनीय के विकास के नए चिकित्सात्मक रणनीतियों के आगमन के साथ महत्वपूर्ण बढ़ती बनता जा रहा है. नई रणनीति का सटीक अध्ययन के लिए पशु मॉडल प्रदर्शन अपेक्षाकृत आसान होना चाहिए, मेटास्टेसिस के एक महत्वपूर्ण संख्या के रूप में, metastatic झरना के सभी चरणों को शामिल और एक पत्रकार प्रणाली है कि पता लगाने और metastatic कोशिकाओं की एक सीमित संख्या के गिनती की अनुमति देता है. विभाजन तिल्ली दृष्टिकोण के रूप में वर्णित एक ही आपरेशन शामिल है और एक अपेक्षाकृत आसान तकनीक carcinomatosis और पोर्टल शिरा घनास्त्रता 1 का एक बहुत कम जोखिम के साथ वर्दी फैलाना जिगर मेटास्टेसिस स्थापित करने के लिए सीखना है. HEMI दो - spleens में तिल्ली के विभाजन का एक Hemi - तिल्ली में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन की अनुमति देते हैं. ट्यूमर कोशिकाओं पोर्टल परिसंचरण में प्रवेश और जिगर के लिए यात्रा, metastatic झरना के पहले कदम नकल उतार. इंजेक्शन Hemi - प्लीहा के छांटना एक प्लीहा - संबंधी ट्यूमर का विकास और अन्य Hemi - तिल्ली की वापसी से बचा जाता है, प्लीहा - संबंधी प्रतिरक्षाविज्ञानी गुण है जो जानवरों की प्रक्रिया से पहले था की अवधारण सुनिश्चित करता है .. इस मॉडल ट्यूमर प्रकार की एक किस्म के लिए उपयोग किया जा सकता है. लुईस फेफड़ों luciferase सेल लाइन जिगर की बीमारी के समय पर bioluminescent मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. bioluminescence प्रणाली की बढ़ी संवेदनशीलता और metastatic कोशिकाओं की एक छोटी संख्या का पता लगाने के परिमाणन की अनुमति देता है. इस उपचार प्रोटोकॉल की दीक्षा के लिए सही समय की अनुमति देता है और जानवर के बलिदान के बिना जिगर की बीमारी की मात्रा का ठहराव के लिए सक्षम बनाता है. सादगी, स्थायित्व, और reproducibility इस मॉडल उपन्यास 2 chemotherapeutics, जीन 3 चिकित्सा और immunotherapy 1,4 सहित विभिन्न उपचार रणनीतियों के अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाते हैं .
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम कॉर्क दक्षिण दुर्बलता विक्टोरिया विश्वविद्यालय अस्पताल स्तन निधि, आयरिश कैंसर सोसायटी (CRI07TAN) और कॉर्क कैंसर रिसर्च सेंटर के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था. लुईस फेफड़ों सेल लाइन stably luciferase व्यक्त डॉ. से एक तरह का उपहार था Karin Jooss, सेल Genesys, इंक, सैन फ्रांसिस्को, संयुक्त राज्य अमरीका.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ketamine | Vétoquinol | ||
| Xylazine | Vétoquinol | ||
| Carprofen | Vétoquinol | ||
| Videne | Ecolab | ||
| Vicryl 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| PDS 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Prolene 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc |
References
- Kasuya, H. Mouse models of subcutaneous spleen reservoir for multiple portal venous injections to treat liver malignancies. Cancer Res. 65, 3823-3827 (2005).
- Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic. World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).
- Li, Z. Y., Ni, S., Yang, X., Kiviat, N., Lieber, A. Xenograft models for liver metastasis: Relationship between tumor morphology and adenovirus vector transduction. Mol Ther. 9, 650-657 (2004).
- Cashman, J. P. Immune gene therapy as a neoadjuvant to surgical excision to control metastatic cancers. Cancer Lett. , (2008).
