Summary
Este artigo descreve um procedimento para a indução de tumores de fígado ortotópico bioluminescentes em camundongos, e posterior análise do crescimento do tumor confinado ao fígado usando imagens de luminescência ao vivo de todo o corpo.
Abstract
Este vídeo descreve o estabelecimento de metástases hepáticas em um modelo de mouse que pode ser posteriormente analisados por imagens bioluminescente. As células tumorais são administrados especificamente para o fígado para induzir um tumor do fígado localizada, por meio da mobilização do baço e dividir em duas, deixando intacto o pedículo vascular para cada metade do baço. Lewis células de carcinoma de pulmão que constitutivamente expressam o gene luciferase do firefly (luc1) são inoculados em um hemi-baço, que é então ressecado 10 minutos depois. A outra hemi-baço é deixada intacta e voltou para o abdômen. O crescimento do tumor do fígado pode ser monitorado por imagem de bioluminescência usando o IVIS sistema de imagem de corpo inteiro. Imagens quantitativas do crescimento tumoral utilizando IVIS fornece a quantificação precisa das células tumorais viáveis. Morte celular e necrose do tumor devido ao tratamento medicamentoso é indicado no início por uma redução no sinal bioluminescente. Este modelo do rato permite investigar os mecanismos subjacentes a sobrevivência das células tumorais metastáticos e crescimento e pode ser usado para a avaliação da terapêutica das metástases hepáticas.
Protocol
Introdução
O fígado é geralmente o primeiro local de doença metastática e pode ser o único local de disseminação em até 30 40% dos pacientes com doença avançada. No entanto opções para o tratamento de tumores hepáticos metastáticos são poucos com uma minoria de pacientes adequados para a ressecção e apenas 23% responderam importante para quimioterápicos. Pesquisa pré-clínica neste campo tem sido limitada pela ausência de um modelo de camundongo adequado para estudar a doença de fígado isolado. Descrevemos uma abordagem baseada em baço, que pode ser usado para definir com fiabilidade uniforme, metástases hepáticas difusas. Ressecção da metade do baço evita as conseqüências do crescimento do tumor esplênico ea outra metade do baço é devolvido com uma circulação portal para manter intacta esplênica imune propriedades protetoras. O modelo que descreve é bastante simples de executar e pode ser feito rapidamente através de uma incisão única. As propriedades bioluminescente da linha celular do tumor permite a quantificação precisa da resposta ao tratamento, sem sacrifício de animais.
Protocolo
I. Preparação celular
- Células de carcinoma de pulmão Lewis são cultivadas Médio Modified Dulbecco Essential suplementado com soro bovino fetal 10% a 37 ° C, 5% CO 2 e colhido por trypsinisation quando sub-confluentes.
- As células foram contadas utilizando um Nucleocounter (Quimio-Metec, Dinamarca) e uma suspensão única célula de 1 X 10 6 células em 200 mL foi preparada em soro de mídia livre.
II. Preparação do mouse
Nota: Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade College Cork. Em nosso laboratório usamos anestésicos injetáveis para anestesiar o rato, alternativamente, pode-se usar anestésicos inalatórios para conseguir o mesmo efeito. A tensão do rato que usamos é o hairless MF1 tensão nu / nu obtido a partir de Harlan Laboratories (Oxfordshire, Inglaterra). MF1 feminino nu / nu camundongos pesando 16-22 g e de 6-8 semanas de idade foram incluídos neste experimento. Outras cepas, como o C57 e Balb / c também pode ser usado com linhagens de células tumorais apropriado.
- A anestesia foi entregue por injeção intraperitoneal de ketamina 100ul de 1,5 mg e 300 ug xilazina.
- A profundidade da anestesia é avaliada através de pinch dedo do pé. Não deve haver reflexo de retirada com pinça dedo do pé.
- O rato anestesiado está corretamente posicionada e fixada sobre uma almofada de aquecimento.
- O abdômen é preparado com uma solução de betadine 10%.
- Do abdômen e do sítio cirúrgico é coberto de forma estéril.
III. Incisão abdominal
- Uma pequena incisão subcostal é feita na pele.
- A incisão é estendida a 2-3 cm.
- A musculatura da parede abdominal foram divididos e cavidade peritoneal entrou.
IV. Exposição e Divisão de Spleen
- O baço é mobilizado e gentilmente exteriorizado em uma gaze estéril pré-cortados.
- Duas ligaduras vicryl 4-0 são amarrados em torno do corpo meados do baço.
- Baço é dividido entre as duas ligaduras a criação de dois hemi-baço.
V. A injeção de células para o baço Hemi-
- A G 27 é usada para injetar um volume de 100 L de células em um hemi-baço.
- As células tumorais são permitidos para drenar para o fígado para 10 minutos dando tempo suficiente para a maioria das células injetadas para chegar ao fígado.
VI. Excisão do baço Hemi-fechamento, Abdominal e Recuperação
- A injeção hemi-baço é extirpado.
- A outra hemi-baço é retornado para a cavidade abdominal.
- A camada muscular é fechada com sutura PDS 4-0 com um ponto simples execução.
- A pele abdominal é fechada com Prolene 4-0 com pontos interrompidos.
- Bolus de fluido é administrado e analgesia pós-operatória, Carpofen (5 mg / kg) é administrado por injecção IP por 24 h após a cirurgia.
- O mouse é permitido recuperar da anestesia
VII. IVIS Corpo Inteiro Bioluminescent Imagem
- Mouse é anestesiados com anestésico injetável.
- Substrato luciferina é dada por injeção intra-peritoneal de dez minutos antes de imagem
- Os ratos são colocados no palco e fotografada por 3 min usando IVIS sistema de imagem de corpo inteiro
- Luminescência do fígado pode ser medida usando uma região de interesse ferramenta
VIII. Exposição de fígado de rato
- Mouse é anestesiados com anestésico injetável.
- A incisão abdominal telhado permite a visualização de metástase hepática difusa in vivo.
- O rato é sacrificados por deslocamento cervical e no fígado pode ser retirado para análise posterior.
_upload/1977/1977fig1.jpg "alt =" Figura 1 "/>
Figura 1. Freshly excisadas não tratada murino e tumor infiltrou-fígados.
Figura 2. Cinética de crescimento do tumor hepático como evidenciado por IVIS imagens de corpo inteiro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O desenvolvimento da confiança em modelos in vivo para o estudo da metástase hepática está se tornando cada vez mais importante com o advento de novas estratégias terapêuticas. Para o estudo precisa de novas estratégias, modelos animais deveria ser relativamente fácil de executar, formam um número significativo de metástase, envolvem todas as etapas da cascata metastática e têm um sistema repórter que permite a detecção e contagem de um número limitado de células metastáticas. A abordagem baseada em baço, conforme descrito envolve uma única operação e é uma técnica relativamente fácil de aprender a estabelecer metástase hepática difusa uniforme com um risco muito baixo de carcinomatose e trombose venosa portal 1. A divisão do baço em dois hemi-baços permitir a injeção de células tumorais em um hemi-baço. As células tumorais entram na circulação portal e viajar para o fígado, imitando o primeiro passo da cascata metastática. Excisão do baço injetado hemi-evita o crescimento de um tumor do baço e do retorno do outro hemi-baço garante a retenção de esplênica propriedades imunológicas que o animal tinha antes do procedimento .. Este modelo pode ser utilizado para uma variedade de tipos de tumor. O pulmão Lewis linha celular luciferase permite a quantificação bioluminescente de doença hepática ao longo do tempo. A sua maior sensibilidade do sistema de bioluminescência permite a detecção e quantificação de um pequeno número de células metastáticas. Isto permite tempo exato para o início de protocolos de tratamento e permite a quantificação da doença hepática sem sacrifício do animal. A simplicidade, durabilidade e reprodutibilidade fazer este modelo adequado para o estudo de estratégias de tratamento diferentes, incluindo dois novos quimioterápicos, a terapia gênica 3 e 1,4 imunoterapia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado através da Enfermaria Cork South Victoria University Hospital fundo do peito, a Sociedade do Câncer irlandês (CRI07TAN) e do Centro de Cork Cancer Research. Lewis linha de pulmão de células expressando estavelmente luciferase foi um presente amável do Dr. Karin Jooss, Cell Genesys, Inc., San Francisco, EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ketamine | Vétoquinol | ||
| Xylazine | Vétoquinol | ||
| Carprofen | Vétoquinol | ||
| Videne | Ecolab | ||
| Vicryl 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| PDS 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Prolene 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc |
References
- Kasuya, H. Mouse models of subcutaneous spleen reservoir for multiple portal venous injections to treat liver malignancies. Cancer Res. 65, 3823-3827 (2005).
- Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic. World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).
- Li, Z. Y., Ni, S., Yang, X., Kiviat, N., Lieber, A. Xenograft models for liver metastasis: Relationship between tumor morphology and adenovirus vector transduction. Mol Ther. 9, 650-657 (2004).
- Cashman, J. P. Immune gene therapy as a neoadjuvant to surgical excision to control metastatic cancers. Cancer Lett. , (2008).
