Summary
В этой статье описывается процедура индукции ортотопической биолюминесцентного опухолей печени у мышей, и последующий анализ опухолевого роста ограничивается печени с использованием живого целого изображения свечения тела.
Abstract
Это видео описывает создание метастазов в печени у мышей, которые могут быть впоследствии проанализированы изображений биолюминесценции. Клетки опухоли находятся в ведении специально для печени, чтобы вызвать локализованных опухолей печени, через мобилизацию селезенки и расщепление на две части, оставив нетронутыми сосудистой ножке для каждой половины селезенки. Карцинома легких Льюис клетки, которые выражают конститутивно ген люциферазы светлячка (luc1) засевают в один геми-селезенки, которая затем резекции через 10 минут. Другие геми-селезенки остается нетронутой и вернулся в животе. Рост опухоли печени можно контролировать с помощью биолюминесценции визуализации с использованием ИВИС всей системы визуализации тела. Количественная визуализация опухолевого роста использования ИВИС обеспечивает точное количественное определение жизнеспособных клеток опухоли. Опухоль гибели клеток и некроза в связи с лекарственной лечение показано раннее снижением биолюминесцентного сигнала. Эта мышь модель позволяет для исследования механизмов, лежащих метастатических опухолевых клеток выживания и роста и может быть использован для оценки терапии печени метастазы.
Protocol
Введение
Печень часто первый сайт метастатической болезни и может быть единственным местом распространения в целых 30 у 40% пациентов с прогрессирующим заболеванием. Однако варианты для лечения метастатических опухолей печени, несколько человек, с меньшинством больных для резекции и только 23% респондентов основным для химиотерапии. Доклинические исследования в этой области было ограничено из-за отсутствия подходящей модели мышей для изучения изолированных заболевания печени. Мы описываем сплит-селезенки подход, который может быть использован для надежно установить единые, диффузные метастазы в печени. Резекция этой половины селезенки позволяет избежать последствий роста опухоли селезенки и другую половину селезенки возвращается с нетронутыми обращение портала для поддержания иммунной селезенки защитные свойства. Модели мы описываем достаточно проста для выполнения и может быть сделано быстро через один разрез. Биолюминесцентного свойства линии опухолевых клеток позволяет точную количественную оценку ответа на лечение без жертвы животных.
Протокол
I. Подготовка сотовый
- Льюис клетки карциномы легких выращиваются изменения основных Дульбеко Средний с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37 ° C, 5% СО 2 и собирают trypsinisation когда суб-вырожденная.
- Клетки были подсчитаны использованием NucleoCounter (химико-METEC, Дания) и суспензии отдельных клеток в 1 X 10 6 клеток в 200 мкл был подготовлен в сыворотке крови свободных средств массовой информации.
II. Мышь Подготовка
Примечание: Все процедуры были одобрены комитетом по этике из Университетского колледжа Корка. В нашей лаборатории мы используем инъекционные анестетики для обезболивания мыши; альтернативно, можно использовать ингаляционных анестетиков для достижения того же эффекта. Мыши штамма мы использовали, голые MF1 ню / ню штамм получен из Харлан Laboratories (Оксфордшир, Англия). Женский MF1 ню / ню мышей весом 16-22 г и 6-8 недельного возраста были включены в этот эксперимент. Другие штаммы, такие как С57 и BALB / C также может быть использована с соответствующей линии клеток опухоли.
- Анестезия была произнесена при введении препарата в 100 мкл 1,5 мг кетамина и 300 мкг ксилазина.
- Глубины анестезии оценивается с помощью ног крайнем случае. Там должно быть никакого вывода рефлекс с ног крайнем случае.
- Наркозом мыши правильно расположен и в записи на грелку.
- Живот нацелен с 10% бетадин решение.
- Брюшной полости и хирургические сайта завернуто в стерильных моды.
III. Разреза брюшной полости
- Небольшой подреберье надрез в коже.
- Разрез продлен до 2-3 см.
- Мускулатуру брюшной стенки были разделены и брюшную полость ввели.
IV. Экспозиция и Отделом Селезенка
- Селезенка мобилизованы и мягко экстериоризируется на нарезанные стерильной марлей.
- Два 4-0 Викрил лигатуры связаны примерно в середине тела селезенки.
- Селезенка разделен между двумя лигатурами создания двух полу-селезенки.
В. Введение клеток в селезенке Hemi-
- 27 G используется для введения 100 мкл объема ячеек в одну геми-селезенки.
- Опухолевые клетки имеют право стекать на печени в течение десяти минут при наличии достаточного времени для большинства вводили клетки достигают печени.
VI. Иссечение Hemi-селезенки, брюшной закрытие и восстановление
- Вводят геми-селезенки вырезали.
- Другие геми-селезенки возвращается в брюшную полость.
- Мышечного слоя закрыта с 4-0 шов PDS с помощью простой работает стежка.
- Кожа живота закрыта с 4-0 Prolene использованием прервал швов.
- Жидкость вводят болюсно и послеоперационного обезболивания, Carpofen (5 мг / кг) находится в ведении IP-инъекции в течение 24 ч после операции.
- Мышь, допускается, чтобы оправиться от наркоза
VII. ИВИС всего тела Биолюминесцентный изображений
- Мышь анестезией использовании инъекционных анестетиков.
- Люциферин подложки задается внутри-перитонеального инъекции за десять минут до визуализации
- Мыши находятся на стадии и отображаемого в течение 3 мин с использованием ИВИС Вся система визуализации тела
- Люминесценция из печени может быть измерена с помощью области интереса инструмент
VIII. Воздействие на печени мышей
- Мышь анестезией использовании инъекционных анестетиков.
- Крыше разреза брюшной полости позволяет выявлять диффузное метастазов печени в естественных условиях.
- Мышь эвтаназии цервикальным сдвигом и печени могут быть изъяты для дальнейшего анализа.
_upload/1977/1977fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Только что вырезали мышиной необработанной и опухоль проникла печень.
Рисунок 2. Кинетика роста опухоли печени, о чем свидетельствует целый ИВИС изображений тела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Разработка надежных в естественных моделей для изучения печени метастазы становится все более важной в связи с появлением новых терапевтических стратегий. Для точного изучения новых стратегий, животных моделях должна быть относительно легко выполнить, образуют значительное количество метастазов, вовлекать все шаги метастатического каскада и иметь репортер система, которая позволяет обнаруживать и подсчета ограниченное число метастатических клеток. Сплит-селезенки подход, как описано включает одну операцию и относительно легко технику, чтобы узнать установить единые диффузного метастазов печени с очень низким риском карциноматоза и воротной вены Тромбоз 1. Разделение на две селезенки геми-селезенки позволяют инъекции опухолевых клеток в одну геми-селезенки. Опухолевые клетки вступают портала обращения и поездки в печени, имитируя первый шаг метастатического каскада. Иссечение вводят геми-селезенки предотвращает рост опухоли селезенки и возвращение других геми-селезенки обеспечивает сохранение селезенки иммунологические свойства, животное было до процедуры .. Эта модель может быть использована для различных типов опухолей. Люциферазы легких Льюис клеточная линия позволяет биолюминесцентного количественного заболевания печени с течением времени. Повышенная чувствительность биолюминесценции система позволяет обнаружение и количественное определение небольшого числа метастатических клеток. Это позволяет точно измерять время для начала лечения протоколов и обеспечивает количественное заболевания печени без жертву животное. Простота, надежность и воспроизводимость делают эту модель подходит для изучения различных стратегий лечения, включая новые химиотерапевтические 2, 3 генной терапии и иммунотерапии 1,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась через Корк Южной больнице Виктория университетской больницы груди фонда, ирландского общества рака (CRI07TAN) и Научно-исследовательского онкологического центра Корка. Легких Льюис клеточной линии стабильно выражения люциферазы был своего рода подарок от доктора Карин Jooss, Cell Genesys, Inc, Сан-Франциско, США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ketamine | Vétoquinol | ||
| Xylazine | Vétoquinol | ||
| Carprofen | Vétoquinol | ||
| Videne | Ecolab | ||
| Vicryl 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| PDS 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Prolene 4-0 suture | Ethicon Inc. | ||
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc |
References
- Kasuya, H. Mouse models of subcutaneous spleen reservoir for multiple portal venous injections to treat liver malignancies. Cancer Res. 65, 3823-3827 (2005).
- Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic. World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).
- Li, Z. Y., Ni, S., Yang, X., Kiviat, N., Lieber, A. Xenograft models for liver metastasis: Relationship between tumor morphology and adenovirus vector transduction. Mol Ther. 9, 650-657 (2004).
- Cashman, J. P. Immune gene therapy as a neoadjuvant to surgical excision to control metastatic cancers. Cancer Lett. , (2008).
