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Neuroscience

쥐 중간 대뇌 동맥의 폐색의 Endovascular 봉합사에 의해 초점 대뇌 국소 빈혈 모델

Published: February 5, 2011 doi: 10.3791/1978
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurological Surgery, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin-Madison

Summary

쥐에서 허혈성 뇌 손상 외과 유도는 뇌졸중 연구 널리 사용되는 모델입니다. 여기서 우리는 중간 대뇌 동맥의 폐색에 의해 초점 대뇌 국소 빈혈의 유도를 보여줍니다. histological 얼룩 및 자기 공명 영상에 의해 발생하는 경색의 시각화도 표시됩니다.

Abstract

행정 장애 1 전 세계 성인 사망의 세 번째 주요 원인의 주요 원인이다. 인간의 뇌졸중에서 높은 변수 임상 상태가 존재, 초점 국소 빈혈의 동물 모델의 개발에, 그러나 실험적으로 유도 경색 볼륨의 재현성을 달성하는 것은 필수적입니다. 쥐는 비교적 낮은 동물 축산 비용과 인간 2,3의하기 위해 두개골 순환의 유사성으로 인해 뇌졸중에 널리 사용되는 동물 모델입니다. 인간에서는, 중간 대뇌 동맥 (MCA)가 가장 일반적으로 뇌졸중 syndromes와 MCA 폐색 (MCAO)의 여러 방법에 영향을받습니다 것은 동물 모델에서이 임상 증후군을 모방하기 위해 설명되었습니다. recanalization은 일반적으로 폐색 기간 후에 인간, reperfusion에 급성 뇌졸중에 따라 발생하기 때문에 이러한 모델의 많은에 포함되었습니다. 이 비디오에서는, 우리는 저절로 신경성 쥐 (SHR)에서 일시 endovascular 봉합 MCAO 모델을 보여줍니다. 실리콘 팁 코팅 필라멘트가 reperfusion 다음 60 분 동안 MCA의 기원에 intraluminally 배치됩니다. 최적의 폐색 기간이 같은 위스타이나 스프 라그 - 돌리 등 다른 쥐의 변종에 따라 다를 수 있습니다. 쥐에서 뇌졸중의 여러 행동 지표가 표시됩니다. 초점 국소 빈혈은 T2 - 가중 자기 공명 이미지를 사용하여 확인 24 시간 MCAO 후 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (TTC)와 두뇌 섹션을 얼룩에 의해. 것입니다

Protocol

MCAO 랫 모델

Presurgical 준비

무균 기술은 모든 생존 수술 절차를 사용해야합니다. 상업 살균제와 함께 수술 작업 표면을 소독하고 autoclaving하여 악기, 커튼, 거즈, 면봉, 봉합, 그리고 메스 블레이드 살균 외과 팩을 준비합니다. 수술 마스크, 헤어 보넷와 멸균 장갑을 착용하여야한다. Germinator 건조 구슬 살균기는 여러 쥐 수술을 한 세션 동안 할 수있다면 절차를 사이에 수술 악기를 resterilize하는 데 사용됩니다. 흡수성 패드 아래에 Prewarm 물 외피 homeothermic 담요과 장소 수술 중 쥐 저체온증을 방지하기 위해서.

  1. 유도 챔버에 자발적 신경성 쥐 (또는 원하는 다른 쥐의 변형) 장소와 함께 5% isoflurane (마취 기계는 1.0 L / 분, O 2 및 1.0 L / 분, N 2 O로 설정되어야합니다.) 마취를 유도 마취를 유지하기 위해 isoflurane 1~2%을 낮춥니다.
  2. 양쪽 눈 모두에 인공 눈물 연고를 적용합니다.
  3. 가위 (# 10 블레이드와 오스터 A5)를 사용하여 예비 절개 사이트 넘어 목구멍과 왼쪽 목에 영역을 쉐이브.
  4. 거즈 패드에 Betadine을 적용하고 바깥쪽으로 나선형으로, 수술이 지역의 중심부터 피부를 소독. 비슷한 패턴의 패드를 움직이는 70 %의 에탄올을 포함하는 멸균 거즈 패드로 헹굼. 세 사이클의 총 단계를 모두 반복합니다.
  5. 예비 절개 사이트를 따라 subcutaneously 0.5 % bupivacaine의 0.2 ML를 주사.
  6. 무균 수술 드레이프와 살균 stockinette 또는 커버 플레이스 쥐.

MCA의 과도 폐색

  1. 운영 현미경, 복부 정중선 절개가 수행되고 표면 근막을 해부합니다.
  2. 마지막으로 sternomastoid 근육, digastric (쉽게 그 반짝 이는 흰색 건의 부분을 통해 식별),기도를 통해 정중선 자리 sternohyoid, : 표면 근막 아래,이 삼각형을 형성 왼쪽 세 근육에 선의 조직입니다.
  3. 주의 샤프하고 무딘 절개는 경동맥 (독점 무딘 절개가 실수로 조직 손상을 최소화하기 위해 일부로 선호있을 수 있습니다)를 파악하기 위해 삼각형 내에서 수행됩니다. , 외부 내부 및 일반 경동맥 동맥은 (ECA, ICA, CCA) 노출됩니다. 경동맥은 크고 가시 펄스입니다. 미주 신경은 일반적으로 내부 경동맥 동맥 모두의 측면을 따라 자, 이제 볼 수 있으며, 크게 일반 및 내부 경동맥 동맥에서 해부하는 것입니다.
  4. 두 ECA의 지점은 다음 첫 번째 분기 medially 제목 두 번째 지점은 옆으로 향하고 급격하게 해부하고 있습니다. 두 가지가 큰 혈관을 동원 더욱 쉽게 허용하는, 불로 지졌죠 및 절단됩니다.
  5. ECA는 이제 더 rostrally 해부하는 것입니다. 설골을가 발생 될 수 있으며이 주동이의 절개의 범위를 제한합니다. 외부 경동맥은 6-0 실크 봉합사로 distally 최대한 떨어져 묶여 있습니다.
  6. 또 다른 6-0 실크 봉합사는 ICA와 분기점 근처 ECA 주위에 느슨하게 배치됩니다. 폐색에 사용될 intraluminal 봉합 나중 단계에서 이곳을 거치는 것입니다로 혈관을 막다하지 않도록하십시오.
  7. Microsurgical 클립은 분기점 근처 일반 및 내부 경동맥 동맥에 표시됩니다.
  8. 초기 부분 arteriotomy은 외부 경동맥에있는 두 개의 실크 봉합사의 유대 사이에 생성됩니다.
  9. microsurgical 클립이있는 CCA쪽으로 ECA 루멘으로의 둥근, 실리콘 코팅 팁에서 꼬임 2.0 cm로 4-0 monofilament 나일론 봉합사의 2.2 -3.0 cm 길이를, 아래 소개합니다. 이러한 봉합은 (Doccol 공단, 레들랜즈, CA, 미국) 상업적으로 사용할 수 있습니다. 선거 유세 및 위치 ECA와 ICA의 분기점 아래의 그루터기를 무료로 ECA의 나머지 부분을 (부분 arteriotomy의 사이트에서) 절단, 이것은 더 쉽게 intraluminal 봉합이 ICA에 슬라이드 수 있습니다.
  10. intraluminal 나일론 봉합사를 안전하고 출혈을 방지하고, 다음 ICA에서 microvascular 클립을 제거하는 ECA 스텀프 주변 실크 봉합사를 조이십시오. 출혈를 확인하기 위해 그것을 제거하기 전에 천천히 클립을 엽니다.
  11. 중간 대뇌 동맥 (MCA)에 ECA에서 ICA 루멘으로 나일론 봉합사를 발전 계속합니다. 이 길이는 일반적으로 18-20밀리미터하고 삽입하기 전에 봉합에 꼬임을 배치하는 이유입니다. 나일론 봉합사의 변수 길이가 삽입되면 저항이 느낄 수 있습니다. 이 많은 선박 외부 여전히 현재 나일론 봉합사의가 발생하면, 그것은 봉합 가능성이 (아래 참고 참조) pterygopalatine 동맥을 입력을 나타냅니다. 후퇴와 곡선 봉합사가 약간 더 medially 실행되는, ICA 따라 계속합니다. 또한, PPA의 기원에 절개가 더 나은 경로를 시각화하기 위해 할 수 있습니다intraluminal 필라멘트니다. 저항이에 있으며 2cm kinked 위치 이후에 생각 때까지 나일론 봉합사를 삽입 계속합니다. 이 시점에서, intraluminal 봉합은 MCA의 출처를 차단했습니다. MCA 폐색은 레이저 도플러 유량계를 (한 장비 소스 재료 테이블을 참조)를 사용하여 지역 대뇌 혈류의 감소를 모니터링하여 확인하실 수 있습니다. 또한 intraluminal 봉합이 선박의 사고 삽관법을 피하기 위해, 원하는 경우 ICA의 해제 pterygopalatine 동맥의 기원이 직접 떨어져 묶여있을 수 있습니다.
  12. 타이머 및 기록 폐색 시작 시간을 시작합니다.
  13. CCA에서 microclip를 제거합니다.
  14. 3-0 실크 봉합사 (간단한 연속 패턴 reperfusion에 대한 재조사 용이하게합니다)와 함께 신속하게 절개를 (진피, panniculus carnosus, 피하 조직 층) 닫고 조심스럽게 복구 케이지에 쥐를 놓습니다. 코와 입 주위 케이지 바닥 침구 소재 및 마취에서 모니터 복구 무료입니다 있는지 확인합니다.

MCA의 혈류의 복원 (reperfusion)

  1. 폐색 기간이 종료해야 직전, 쥐를 다시 마취 Betadine 70 %의 에탄올 (3주기, 이전과) 함께 절개 사이트를 소독하고 닫는 봉합을 제거하여 절개를 다시 엽니다.
  2. 이전처럼, CCA에 microclip 놓으십시오.
  3. 봉합사의 끝이 ICA를 통해 볼 때까지 ICA에서 occluding의 봉합의 파트를 철회가. 완전히 ICA / ECA에서 봉합사를 제거하지 마십시오!
  4. intraluminal 봉합사의 끝을 위 ICA에 microclip 놓으십시오.
  5. 완전히 occluding의 봉합사를 제거하고 단단히 ECA 스텀프를 묶을. 폐색의 기록 엔드 (reperfusion 시작) 시간.
  6. ICA에서 microclip를 제거합니다.
  7. CCA에서 microclip를 제거합니다.
  8. 멸균 생리 여러 방울과 함께 지역을 축축하게하다 간단한 중단 패턴을 사용하여 3-0 실크 봉합사와 절개의 레이어를 (진피, panniculus carnosus, 피하 조직) 닫습니다.
  9. 복막 공간에 (당신의 제도적 지침에 따라 또는 기타 적절한 사후 수술 진통제) 0.05 밀리그램 / kg buprenorphine을 관리할 수 있습니다.
  10. prewarmed 생리 intraperitoneally의 5cc를 주입. 이것은 복구 단계에서 수화를 제공합니다.
  11. 마취에서 암흑의 복구를 모니터링합니다.
  12. 쥐가 회복되면 꼬리로 쥐를 개최하고 쥐가 양쪽을 설정할 수 있는지 여부를 관찰하여 경색의 행동 표시를위한 시험. 한쪽으로 컬링은 예정입니다. 간단한 점수 비늘이 (토론 참조) 초기 이후 경색 behavorial 기능을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.
  13. buprenorphine (위와 동일 투여)의 추가 주사는 통증의 24 시간을위한 모든 6-8시간 부여해야합니다. 동물 불편의 흔적을 보여주는 경우 진통제를 확장합니다.

대표 결과

그림 1
그림 1. endovascular 봉합사에 의해 중간 대뇌 동맥의 폐색이. 쥐의 두개골 순환 시스템의 단순화 그림은 MCA의 출처를 occluding 실리콘 코팅 intraluminal 봉합과 함께 표시됩니다. 왼쪽 ECA의에서 OA 및 ST 지점은 출혈도 잡았 및 ECA 그루터기 주위 봉합의 넥타이는 장소에 intraluminal 봉합을 보유하고 있습니다. ACA, 앞의 대뇌 동맥, BA, 두개골 기저부의 동맥, CCA, 일반 경동맥, ECA, 외부 경동맥, ICA, 내부 경동맥, MCA, 중간 대뇌 동맥, OA, 후두 동맥, PCA, 후부 대뇌 동맥, PComA, 사후 통신 동맥, PPA, pterygopalatine 동맥, ST, 우수한 갑상선 동맥. 사사키 외. 4 리 3 적응 그림.

그림 2
그림 2. 쥐의 뇌 24 시간 코로나 섹션의 대표 자기 공명 이미징 1 시간 과도 MCAO 후. 초점 국소 빈혈을 동반 뇌 부종은 T2 - 가중 MRI 이미지 시각이다. 경색 영역 T2 이미지 (밝은) hyperintense 나타납니다. 비슷한 경색 패턴은 이러한 확산 - 가중 이미지와 5 단계를 매핑 겉보기 확산 계수와 같은보다 고급 MRI 기술을 볼 수 있습니다.

그림 3
그림 3. 쥐 두뇌의 대표 코로나 섹션 1 시간 과도 MCAO 후 TTC 24시간 물들일. TTC의 얼룩은 그림 2에 표시된 것과 같은 쥐의 대뇌 피질과 striatum의 흰색 (흠없는) infarcted 영역을 보여줍니다. 결정 최종 경색 영역 histologically T2 병변보다 약간 작은 수 있지만 초점 허혈성 병변의 일반적인 패턴이, MRI T2 - 가중 영상에서 본 것과 유사한입니다.

Discussion

대뇌 국소 빈혈의 설치류 모델은 글로벌 또는 초점과 같은 가역 또는 돌이킬으로 분류하실 수 있습니다. 우리는 인간의 뇌졸중 환자에서 다음과 같은 recanalization을 발생할 수 reperfusion 부상을 모방하기 위해 가역 초점 국소 빈혈 모델을 사용합니다. 동안 쥐의 주 인간, 윌리스와 일관성이 경색 볼륨 6 leptomeningeal anastomoses 결과의 서클로 인한 광범위한 intracranial 부수적인 순환과 유사한 두개골 순환의 장점. 경색의 크기는 70-10 normotensive 쥐에 비해 초점 대뇌 국소 빈혈에 노출 SHRs 더욱이기 때문에 우리는 저절로 신경성 쥐 (SHR) 변형을 사용합니다. SHRs의 행정 유도도 더 일관성 있고 다른 일반적으로 사용되는 종자 11보다 사망률을 생성할 수 있습니다. 변동 경색 볼륨의 다양성에 추가할 수 있기 때문에뿐만 아니라, 생리적 매개 변수, 수술 전반에 걸쳐 모니터링해야합니다, 이러한 매개 변수는 허혈성 부상에게 2,12 증명했다 수있는 혈압, 동맥 O 2, CO 2 레벨, 저체온증과 고혈당증를 포함 . 그것이 필수적인 수술 중에 thermoregulatory 가열 패드에 밀고를 삽입, 따라서의 연결 허혈성 손상의 정도를 완화하고, 저체온 수 있기 때문에 특정 관심사입니다.

우리는 상업 경색 크기 13-15의 일관성을 향상하기 위해이 절차에 실리콘 코팅 봉합을 준비하는 회사들도 있습니다. 전통적으로, MCA를 막다하는 데 사용 intraluminal 봉합은 불꽃 - 반올림 3-0 나일론 봉합사 팁 또는 코팅 작은 구슬 접착제 16로 봉합 팁를 뜨거운 아교 총을 사용하여 준비하고 있습니다. 이러한 절차는 특정 암흑의 혈관 직경에 맞는 치료를 찾는 전에 폐색에 여러 번 시도해야 할 수도 있습니다, 따라서 다양한 팁 직경과 함께 봉합을 생산합니다. 이 동영상에 설명되어있는 MCAO 방법에 대한 자세한 차이는 부수적인 혈액 흐름 6,9을 줄이기 위해 순수한 대뇌 피질의 경색 17 및 MCA와 ipsilateral 일반적인 경동맥의 동시 폐색을하기 위해 lenticulostriate 지점을 살려주는 더 말초 폐색을 포함합니다.

뇌졸중의 기능적 효과는 특정 작업에 적자가 단순한 점수 규모에 반영하는 행동 테스트의 다양한 사용 평가하실 수 있습니다. 예를 들어, Bederson 외. 18 강화된 신체 위치, 수평 밀어 비대칭 저항, 그리고 오픈 필드 돌고 행동 forelimb 굴곡의 범위에 신경 점수 등급 쥐를 개발하였습니다. 고가와 다른 적자를 전시없는 경우 바닥에 두 앞발을 확장 쥐 평점 있었다 "일반 (0)", contralateral forelimb 굴곡과 쥐에만 "보통 결손 (1)"로 분류되었다 반면. "심한 학년 2"쥐가 측면 강제로 contralateral 측면에 감소 저항을 표시하고 "심한 학년 3"쥐 또한 행동을 휘감은에 종사. 낮은 등급 행동 적자는 항상 다음 높은 학년 관찰 (예, 등급 2도 forelimb 굴곡을 표시 3 동물) 및 이러한 점수는 경색의 크기 18 차이 예측 하였다. 따라서, 이러한 단순한 채점 시스템은 행정의 기능 적자의 급속한 일관성 세미 양적 평가 수 있습니다.

대뇌 경색의 범위 측정은 일반적으로 TTC, cresyl 바이올렛 (Nissl는 얼룩) 또는 hematoxylin 및 eosin를 사용하여 조직 손상에 대한 histological 염색법에 의해 수행됩니다. 를 포함하여 확산 - 가중 폐색 후, 조직을 수확 필요없이 각각의 쥐의 경색 볼륨의 결정에 대한 허용 초기 시간 지점에서 경색을 시각화하기 위해 MRI. 자기 공명 이미징 기술, 이미징 MCAO 후 밀고 있지만 이전에 치료 관리는 변화의 혼란함을 주죠 효과를 감소, 모든 실험 및 제어 동물이 시작 유사한 뇌졸중을 경험하는 조사의 신뢰를 제공, 이것은 스트로크에 따라 neuroprotective 치료의 효능을 결정하기위한 연구에 특히 가치가있다 뇌졸중 유도 인치

Disclosures

저자는 공개하지 충돌 관심이 없습니다.
이 프로토콜은 실험 동물의 사용을위한 건강 지침 국립 연구소에 의해 의학 및 공중 보건과 abides의 위스콘신 - 매디슨 대학 학교 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

Acknowledgments

우리는 베스 라우흐와 위스콘신 대학의 자기 공명 이미징을위한 작은 동물 이미징 시설을 주셔서 감사합니다. 위스콘신 - 매디슨 대학에서 신경 외과의학과이 작품에 대한 자금을 제공했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture Doccol Corporation 2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter
Spontaneously hypertensive rats Charles River Laboratories 290-300 g, male
Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads Gaymar Industries
Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit Summit Hill Laboratories
Germinator 500 glass bead sterilizer CellPoint Scientific
Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor TSI Inc.

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References

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