Summary
אינדוקציה כירורגי של נזק מוחי איסכמי בחולדה הוא מודל בשימוש נרחב עבור מחקר שבץ. כאן אנו מדגימים את האינדוקציה של איסכמיה מוחית המוקד על ידי חסימה של עורק המוח האמצעי. ויזואליזציה של האוטם שהתקבל על ידי צביעה היסטולוגית ו דימות בתהודה מגנטית מוצג גם.
Abstract
שבץ הוא הגורם המוביל של נכות הגורם השלישי למוות בקרב מבוגרים ברחבי העולם 1. ב שבץ אדם, קיים מצב קליני משתנה מאוד; בפיתוח של מודלים בבעלי חיים של איסכמיה מוקדי, לעומת זאת, השגת שחזור של נפח האוטם המושרה בניסוי היא חיונית. החולדה היא מודל החיה בשימוש נרחב עבור שבץ בשל עלויות נמוכות יחסית בעלי חיים ועל הדמיון של זרימת הגולגולת שלו לזו של בני האדם 2,3. בבני אדם, עורק המוח האמצעי (MCA) מושפע לרוב תסמונות שבץ שיטות מרובות של MCA חסימה (MCAO) תוארו לחקות זו תסמונת קליניים במודלים של בעלי חיים. מכיוון recanalization נפוצה בעקבות שבץ חריף reperfusion, אדם לאחר תקופה של חסימה נכללה רבים של המודלים האלה. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את המודל חולף endovascular MCAO תפר בחולדה יתר לחץ דם באופן ספונטני (SHR). נימה עם ציפוי קצה סיליקון ממוקם intraluminally על המקור MCA במשך 60 דקות, ואחריו reperfusion. ראוי לציין, כי תקופת חסימה אופטימלית עשויים להשתנות זני עכברים אחרים, כגון Wistar או Sprague-Dawley. מדדים התנהגותיים כמה שבץ החולדה מוצגות. איסכמיה מרחק הוא אישר באמצעות T2 משוקלל תמונות תהודה מגנטית ועל ידי צביעת חלקים במוח עם כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) 24 שעות לאחר MCAO.
Protocol
MCAO דגם עכברוש
Presurgical ההכנות
טכניקה אספטי אמור לשמש את כל הליכי הישרדות כירורגית. לחטא את משטח העבודה כירורגית עם חומר חיטוי מסחרי ולהכין חבילות כירורגיות סטריליות של מכשירים, וילונות, גזה, מטליות, התפרים, ולהבי אזמל ידי מעוקר. מסכה כירורגית, מצנפת שיער כפפות סטריליות צריך להיות משוחק. יבש Germinator חרוז מעקר משמש גם כדי לחטא מחדש מכשירי ניתוח בין אם הליכי ניתוחים עכברוש מרובים ייעשה במהלך אחד. שמיכה Prewarm מים במקטורן homeothermic מקום תחת משטח סופג כדי למנוע היפותרמיה של עכברוש במהלך הניתוח.
- המקום ספונטני עכברוש יתר לחץ דם (או זן עכברים אחרים של בחירה) לתוך תא אינדוקציה לגרום הרדמה עם 5% isoflurane (מכונת הרדמה צריך להיות מוגדר O 1.0 L / 2 דקות ו - 1.0 ליטר / דקה N 2 O). התחתון כדי% 1-2 isoflurane לשמור על הרדמה.
- החל מלאכותית משחה דמעות בשתי העיניים.
- לגלח את הגרון באזור צוואר שמאל מעבר לאזור החתך פוטנציאליים באמצעות קוצץ (אוסטר A5 עם להב 10 #).
- החל בבטאדין לרפד גזה ולחטא את העור החל במרכז אזור הניתוח, מתפתלת החוצה. לשטוף עם תחבושת סטרילית המכילה 70% אתנול, העברת פנקס דפוס דומה. חזור על שני השלבים עבור סכום כולל של שלושה מחזורים.
- להזריק 0.2 מ"ל של bupivacaine 0.5% מתחת לעור לאורך באתר חתך פוטנציאליים.
- המקום עכברוש Stockinette כיסוי סטרילי או עם וילון כירורגי סטרילי.
חסימה חלוף של MCA
- תחת מיקרוסקופ ההפעלה, חתך קו האמצע הגחון מבוצע ואת fascia השטחית הוא גזור.
- מתחת fascia השטחי, יש רקמה בלוטית לשרירים שמאל ושלושה היוצרים משולש: sternohyoid, הנמצאת על קו האמצע קנה הנשימה; digastric (המזוהה בקלות עם חלק tendinous מבריק לבן שלה); ולבסוף, השריר sternomastoid.
- דיסקציה חריפה ובוטה זהירות מתבצע בתוך המשולש כדי לזהות את העורק הראשי (דיסקציה קהה בלעדי עשוי להיות מועדף על ידי חלק למזער נזק לרקמות מקרי). עורקי התרדמה חיצוני, פנימי משותף (ECA, ICA, המרכז לאמנות עכשווית) נחשפים. העורק הראשי הוא גדול לעין פולסים. העצב התועה נראה זורם לאורך הפן לרוחב של שני עורקי הראש המשותף פנימיים הוא ניתח בחריפות את עורקי הראש נפוצים פנימי.
- שני סניפים ECA הם גזור אז בחריפות, את הסניף הראשון הכותרת מדיאלית ואת הסניף השני הכותרת רוחבית. ענפים שניהם צרוב וחותכים, אשר מאפשר בקלות רבה יותר בגיוס כלי גדול יותר.
- ECA הוא גזור עכשיו יותר rostrally. עצם הלשון ניתן נתקל והדבר יגביל את מידת לנתיחה מקורי. בעורק התרדמה החיצוני נקשר כמו distally האפשרי עם תפר 6-0 משי.
- תפר עוד 6-0 משי מונחת ברישול סביב ECA ליד הסתעפות עם הרשפ"ת. הקפד לא כדי לחסום את כלי כמו תפר intraluminal לשמש חסימה יהיה עובר כאן בשלב מאוחר יותר.
- קליפים Microsurgical ממוקמות על עורקי הראש נפוצים פנימי ליד הסתעפות.
- Arteriotomy חלקית הראשונית נוצרת בין שני לתפור עניבות משי על עורק הצוואר חיצוני.
- להכניס 2.2 -3.0 ס"מ אורך של תפר monofilament ניילון 4-0, עם 2.0 ס"מ שריטה מ מעוגל קצהו סיליקון מצופה, לתוך לומן ECA מטה לכיוון המרכז לאמנות עכשווית שבה קליפ microsurgical ממוקם. תפרים אלה זמינים מסחרית (Doccol קורפ, Redlands, קליפורניה, ארה"ב). חותכים את החלק הנותר של ECA (באתר של arteriotomy החלקי) לשחרר את הגדם ולמקם את הגדם מתחת הסתעפות של ECA ויק"א, זה יהיה בקלות רבה יותר לאפשר תפר intraluminal להחליק לתוך ICA.
- הדק את תפר משי סביב הגדם ECA כדי לאבטח את תפר ניילון intraluminal ולמנוע דימום, ולאחר מכן להסיר את הסרטון כלי הדם של ICA. פתח את הסיכה לפני הסרת לאט זה כדי לבדוק אם הדימום.
- המשך קידום תפר ניילון מ ECA כדי ICA לומן על עורק המוח האמצעי (MCA). אורך זה הוא בדרך כלל 18-20 מ"מ הסיבה הצבת שריטה תפר לפני הכניסה. לאחר באורך משתנה של תפר ניילון מוכנס, התנגדות יורגשו. אם זה קורה עם הרבה תפר ניילון הנוכחי עדיין מחוץ הספינה, מעידה על כך תפר צפוי להיכנס עורק pterygopalatine (ראה הערה להלן). משוך לאחור עקומת תפר מעט להמשיך לאורך הרשפ"ת, אשר ירוצו יותר מדיאלית. בנוסף, דיסקציה המוצא של PPA ניתן לעשות כדי להמחיש טוב יותר את הנתיבשל החוט intraluminal. המשך להכניס את תפר ניילון עד ההתנגדות היא הרגישה ואחרי עמדה 2 ס"מ מפותל. בשלב זה, תפר intraluminal חסם את מקורם של MCA. MCA חסימה יכולה להיות מאושרת על ידי ניטור הפחתה בזרימת הדם במוח האזורית באמצעות flowmeter לייזר דופלר (ראה טבלה חומרים ממקור אחד ציוד). כמו כן לציין כי מקורו של העורק pterygopalatine הנחה של הרשפ"ת יכול להיות קשור ישירות לדרך, אם העדיף, על מנת למנוע מקרי אינטובציה של כלי זה עם תפר intraluminal.
- הפעל את שעון העצר חסימה שיא הזמן להתחיל.
- הסר את microclip מן המרכז לאמנות עכשווית.
- סגירת החתך (הדרמיס, מרפד carnosus, שכבות רקמה תת עורית) במהירות עם תפר 3-0 משי (דפוס מתמשך פשוט יקל על פתיחתו מחדש של reperfusion) ובזהירות המקום חולדה בכלוב התאוששות. בדוק את רצפת כלוב סביב האף והפה חופשיים החומר מצעים התאוששות לפקח מן ההרדמה.
שחזור זרימת הדם MCA (reperfusion)
- זמן קצר לפני תקופת חסימה צריכה להסתיים, להרדים מחדש את העכברוש, לחטא את האתר חתך בבטאדין אתנול ו 70% (3 מחזורים, כמו קודם) ולפתוח מחדש את החתך על ידי הסרת התפרים הסגירה.
- מניחים microclip על המרכז לאמנות עכשווית, כמו קודם.
- למשוך את תפר occluding חלקית של ICA עד סוף תפר גלוי דרך ICA. לא לגמרי להסיר את תפר של ICA / ECA!
- מניחים microclip על ICA מעל בסוף תפר intraluminal.
- להסיר לחלוטין את תפר occluding בחוזקה לקשור את הגדם ECA. שיא סוף חסימה (להתחיל reperfusion) זמן.
- הסר את microclip של ICA.
- הסר את microclip מן המרכז לאמנות עכשווית.
- לחלח את האזור עם מספר טיפות של תמיסת מלח סטרילית לסגור את החתך שכבות (הדרמיס, מרפד carnosus, רקמה תת עורית) עם תפר 3-0 באמצעות דפוס משי קטע פשוט.
- ניהול 0.05 מ"ג / ק"ג עצירות (או משכך כאבים אחר המתאים שלאחר הניתוח שלהלן הנחיות מוסדיים שלך) לחלל הצפק.
- הזרק 5cc של intraperitoneally מלוחים prewarmed. זה יספק לחות בשלב ההתאוששות.
- צג התאוששות של חולדה מן ההרדמה.
- אחרי החולדה התאוששה, מבחן אינדיקציה התנהגותית של אוטם ידי החזקת את העכברוש בזנבו והתבוננות אם עכברוש יכול לפנות לשני הצדדים. קרלינג לצד אחד בלבד צפוי. קשקשים הניקוד פשוט יכול לשמש כדי להקליט תפקוד הראשונית שלאחר האוטם behavorial (ראה דיון).
- זריקות נוספות של עצירות (מינון כמו לעיל) יש לתת כל 6 עד 8 שעות במשך 24 שעות של הקלה בכאב. הרחבת כאבים אם החיה מראה סימנים של אי נוחות.
נציג תוצאות
באיור 1. חסימה של עורק המוח האמצעי על ידי תפר endovascular. דיאגרמה פשוטה של מערכת הדם גולגולת של עכברוש מוצג עם תפר סיליקון מצופה intraluminal occluding מקורם של MCA. OA וענפים ST מעל ECA שמאל כבר ligated ועניבה תפר סביב הגדם ECA מחזיקה תפר intraluminal במקום. ACA, עורק המוח הקדמי: BA, basilar העורק; המרכז לאמנות עכשווית, העורק הראשי משותפת; ECA, חיצוני עורק התרדמה, ICA, עורק התרדמה הפנימי, MCA, עורק המוח האמצעי, OA, עורק העורפית, PCA, עורק המוח האחורי; PComA, האחורי תקשורת העורק; PPA, עורק pterygopalatine: ST, עורק התריס מעולה. איור עיבוד סאסאקי et al. 4 ולי 3.
איור 2. נציג תהודה מגנטית סעיפים העטרה של המוח עכברוש 24 שעות לאחר חלוף MCAO 1 שעה. בצקת מוחית המלווה איסכמיה היא מוקד דמיינו T2 משוקלל תמונות MRI. אזור האוטם מופיע hyperintense (בהיר) על תמונות T2. דפוסי האוטם דומים ניתן לראות יותר עם טכניקות מתקדמות כגון MRI-הדמיה דיפוזיה משוקלל מקדם דיפוזיה לכאורה מיפוי 5.
איור 3. סעיפים העטרה נציג של המוח עכברוש מוכתם TTC 24 שעות לאחר חלוף MCAO 1 שעה. מכתים TTC מגלה לבן (בלא כתם) infarcted אזורים בקליפת המוח בסטריאטום ב עכברוש זהה לזה שמוצג באיור 2. שים לב כי הדפוס הכללי של נגעים איסכמיים מוקד דומה לזה לראות את T2 משוקלל בתמונות MRI, אם כי באזור האוטם הסופי נקבע בהיסטולוגיה עשוי להיות מעט קטן יותר מאשר הפגיעה T2.
Discussion
מודלים מכרסם של איסכמיה מוחית יכולה להיות מסווגת העולמי או מוקדי הפיך כמו או בלתי הפיך. אנו משתמשים במודל הפיך איסכמיה מוקד על מנת לחקות את הפגיעה reperfusion שעלול להתרחש recanalization הבאים לחולי שבץ אדם. בעוד חולדה מניות היתרון של מחזור הגולגולת דומה האדם, את זרימת נרחב בטחונות תוך גולגולתי עקב מעגל של וויליס leptomeningeal anastomoses תוצאות בכמויות האוטם עקבי 6. אנו משתמשים עכברוש יתר לחץ דם באופן ספונטני (SHR) זן בגלל גודל האוטם הוא יותר SHRs חשופים איסכמיה מוחית מוקד לעומת חולדות normotensive 7-10. אינדוקציה שבץ SHRs גם עקבית יותר ועלול ליצור תמותה נמוך יותר מאשר זנים נפוצים אחרים 11. בנוסף, פרמטרים פיזיולוגיים יש לעקוב לאורך כל הניתוח, מפני תנודות יכול להוסיף ההשתנות בכמויות האוטם; פרמטרים אלו כוללים לחץ דם עורקי O 2 ו-CO 2 רמות, היפותרמיה, ועל היפרגליקמיה, אשר יכול להחמיר פגיעה איסכמית 2,12 . היפותרמיה הוא מדאיג במיוחד משום שהוא יכול להפחית את מידת פגיעה עצבית איסכמית, ולכן הצבת חולדה על כרית חימום thermoregulatory במהלך הניתוח היא חיונית.
אנו מעסיקים מוכן מסחרית סיליקון מצופה התפרים בהליך זה בניסיון להגדיל עקביות בגודל האוטם 13-15. באופן מסורתי, התפרים intraluminal להשתמש כדי לחסום את MCA הוכנו על ידי להבה עיגול טיפ 3-0 ניילון תפר או באמצעות אקדח דבק חם את קצה המעיל תפר עם דבק קטן חרוז 16. נהלים אלה לייצר התפרים בקטרים קצה שונות, ובכך, עשויה לדרוש מספר ניסיונות על חסימה לפני מציאת תפר התואמת את קוטר כלי שיט של עכברוש נתון. וריאציות נוספות על השיטה MCAO המתואר וידאו זה כוללים חסימה דיסטלי יותר, חוסך את הענפים lenticulostriate כדי להיות אוטם קורטיקלי טהור 17, חסימה זמנית של השפעת MCA ו ipsilateral העורק הראשי משותף להפחית את זרימת הדם בטחונות 6,9.
ההשפעות תפקודית של שבץ ניתן להעריך באמצעות מגוון של בדיקות התנהגותיות, שבו חסרים משימות ספציפיות באים לידי ביטוי בהיקף מניה פשוטה. לדוגמה, פיתחה Bederson et al. לדירוג 18 חולדות נוירולוגיות ציון על מידת כיפוף forelimb במצב גוף גבוה, עמידות אסימטרית לדחוף לרוחב, והתנהגות שדה פתוח מקיף. חולדות הן הארכת forelimbs על הרצפה כאשר מוגבה לא מציג גירעונות אחרים דורגו "Normal (0)", ואילו בחולדות עם כיפוף forelimb הנגדי רק סווגו עם "הגירעונות מתונה (1)". "חמור 2 כיתה" חולדות מוצגת התנגדות ירד בצד הנגדי לכוח לרוחב ו - "חמור בדרגה 3" חולדות עוסקת בנוסף מסתובבים התנהגויות. גירעונות התנהגותיים ציון נמוך נצפו תמיד בכיתה גבוהה הבא (למשל, כיתה 2 ו -3 בעלי חיים מוצג גם כיפוף forelimb) ועשרות אלה היו חזוי של ההבדלים בגודל האוטם 18. לכן, כגון מערכת ניקוד פשוטה מאפשר הערכה מהירה, וכמותיות עקבית של הגירעונות פונקציונלי משבץ.
מדידה של היקף אוטם מוחי נעשה בדרך כלל על ידי צביעה היסטולוגית עבור נזק לרקמות באמצעות TTC, סגול cresyl (Nissl כתם) או hematoxylin ו eosin. תהודה מגנטית טכניקות, כולל דיפוזיה משוקלל MRI כדי להמחיש את האוטם בנקודות זמן מוקדם אחרי חסימה, לאפשר לקביעת נפח האוטם ב עכברוש בנפרד ללא צורך קצירת רקמות. זה חשוב במיוחד במחקרים שמטרתם לקבוע את יעילות הטיפול neuroprotective בעקבות שבץ; הדמיה את העכברוש לאחר MCAO אבל הממשל טיפול לפני נותן אמון החוקר כי כל חיות הניסוי ובקרה מנוסה משיכות דומה להתחיל, הפחתת תופעות בלבול של השתנות ב אינדוקציה שבץ.
Disclosures
המחברים אין אינטרסים מנוגדים לחשוף.
פרוטוקול זה אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש בבית הספר באוניברסיטת ויסקונסין במדיסון לרפואה לבריאות הציבור פועלת לפי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לשימוש בחיות מעבדה.
Acknowledgments
אנו מודים בית ראוך של אוניברסיטת ויסקונסין חיה קטנה הדמיה מתקן עבור דימות בתהודה מגנטית. המחלקה לכירורגיה נוירולוגיות באוניברסיטת ויסקונסין במדיסון סיפק מימון עבור עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon suture | Doccol Corporation | 2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter | |
| Spontaneously hypertensive rats | Charles River Laboratories | 290-300 g, male | |
| Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads | Gaymar Industries | ||
| Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit | Summit Hill Laboratories | ||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | CellPoint Scientific | ||
| Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor | TSI Inc. |
References
- van Gijn, J., Dennis, M. S. Issues and answers in stroke care. Lancet. 352, Suppl 3. SIII23-27 (1998).
- Macrae, I. M. New models of focal cerebral ischaemia. British Journal of Clinical Pharmacology. 34, 302-302 (1992).
- Lee, R. M. Morphology of cerebral arteries. Pharmacol Ther. 66, 149-173 (1995).
- Sasaki, M., Honmou, O., Kocsis, J. D. A rat middle cerebral artery occlusion model and intravenous cellular delivery. Methods Mol Biol. 549, 187-195 (2009).
- Bråtane, B. T., Bastan, B., Fisher, M., Bouley, J., Henninger, N. Ischemic lesion volume determination on diffusion weighted images vs. apparent diffusion coefficient maps. Brain Res. 1279, 182-188 (2009).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Dogan, A., Başkaya, M. K., Rao, V. L., Rao, A. M., Dempsey, R. J. Intraluminal suture occlusion of the middle cerebral artery in Spontaneously Hypertensive rats. Neurol Res. 20, 265-270 (1998).
- Ogata, J., Fujishima, M., Morotomi, Y., Omae, T. Cerebral infarction following bilateral carotid artery ligation in normotensive and spontaneously hypertensive rats: a pathological study. Stroke. 7, 54-60 (1976).
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
- Duverger, D., MacKenzie, E. T. The quantification of cerebral infarction following focal ischemia in the rat: influence of strain, arterial pressure, blood glucose concentration, and age. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 449-461 (1988).
- Coyle, P. Different susceptibilities to cerebral infarction in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Sprague-Dawley rats. Stroke. 17, 520-525 (1986).
- Slivka, A. P. Hypertension and hyperglycemia in experimental stroke. Brain Res. 562, 66-70 (1991).
- Bouley, J., Fisher, M., Henninger, N. Comparison between coated vs. uncoated suture middle cerebral artery occlusion in the rat as assessed by perfusion/diffusion weighted imaging. Neurosci Lett. 412, 185-190 (2007).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156, 161-165 (2006).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical neurology. 24, 47-51 (1985).
- Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
