Summary
Хирургическое индукции ишемического повреждения головного мозга у крыс широко используется модель развития инсульта исследований. Здесь мы показываем, индукции фокальной ишемии головного мозга при окклюзии средней мозговой артерии. Визуализация в результате инфаркта на гистологическое окрашивание и магнитно-резонансная томография также показано на рисунке.
Abstract
Инсульт является ведущей причиной инвалидности и третьей ведущей причиной смерти у взрослых во всем мире 1. В человеческом инсульт, существует сильно варьирует клиническое состояние, в развитие животноводства модели фокальной ишемии, однако, достижение воспроизводимости экспериментально индуцированной инфаркта объеме имеет важное значение. Крыса широко используется животной модели развития инсульта из-за относительно низких затратах животноводства и сходство его черепной обращении к этому людей 2,3. У людей, средней мозговой артерии (СМА) наиболее часто поражаются инсульта синдромов и несколько методов MCA окклюзии (MCAO) были описаны для имитации этого клинического синдрома на животных моделях. Потому что реканализация обычно происходит после острого инсульта в организме человека, реперфузия после периода окклюзии была включена во многих из этих моделей. В этом видео, мы демонстрируем переходных эндоваскулярной шва MCAO модели спонтанно гипертензивных крыс (SHR). Нить с покрытием кончик кремния находится intraluminally в начале координат MCA в течение 60 минут, после чего реперфузии. Обратите внимание, что оптимальный срок окклюзии могут отличаться в других штаммов крыс, такие как линии Вистар или Sprague-Dawley. Несколько поведенческих индикаторов развития инсульта у крыс показано. Фокусное ишемии подтверждается использованием Т2-взвешенных изображений магнитного резонанса и окрашиванием мозга секций с 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорид (ТТС) 24 часов после MCAO.
Protocol
MCAO Крыса Модель
Подготовка предоперационного
Асептическая техника должна использоваться для всех выживания хирургических процедур. Лечить хирургических рабочую поверхность с коммерческими дезинфицирующих и подготовить стерильный хирургический пакеты документов, шторы, марлю, тампоны, швы, и лезвия скальпеля в автоклаве. Хирургическую маску, волосы капота и стерильные перчатки. Germinator сухой шарик стерилизатор также используется для стерилизуйте хирургических инструментов между процедурами, если несколько операций крыса будет сделано в течение одной сессии. Prewarm с водяной рубашкой теплокровных одеяло и место под абсорбирующей прокладки для предотвращения гипотермии у крыс во время операции.
- Место спонтанно гипертензивных крыс (или другого линия крыс по выбору) в индукции камеры и вызывать анестезию с 5% изофлуран (наркозный аппарат должен быть установлен до 1,0 л / мин O 2 и 1,0 л / мин N 2 O). Нижняя до 1-2% изофлуран для поддержания анестезии.
- Применение искусственного мазь Слезы на обоих глазах.
- Бритье горло и оставила область шеи за пределы предполагаемого места разреза использовании ножницы (Остер A5 с лезвием № 10).
- Применить Бетадин к марлевым тампоном и дезинфицировать кожу, начиная от центра хирургической области, спирали наружу. Промыть стерильной марли площадку, содержащие 70% этанола, двигаясь площадку в аналогичной схеме. Повторите оба шага в общей сложности трех циклов.
- Inject 0,2 мл 0,5% бупивакаина подкожно вдоль предполагаемого места разреза.
- Место крысы в стерильных Stockinette или накрыть стерильной хирургической драпировка.
Переходные окклюзии СМА
- Под операционным микроскопом, вентральный вырез средней линии не производится, и поверхностной фасции изрезана.
- Под поверхностной фасции, есть железистой ткани слева и три мышцы, которые образуют треугольник: грудинно-подъязычный, которая лежит на средней линии трахеи; двубрюшной (легко отождествить с его блестящей белой сухожильной части) и, наконец, грудино-сосцевидный мышцы.
- Тщательное острые и тупые рассечение производится в рамках треугольника определить сонной артерии (эксклюзивный тупой диссекции может быть предпочтительным, некоторые, чтобы минимизировать случайные повреждения ткани). Внешние, внутренние, так и общей сонной артерии (ЭКА, ICA, CCA) подвергаются. Сонной артерии большого и заметно импульсов. Блуждающего нерва видно бегущую вдоль наружной стороны как общих, так и внутренней сонной артерии и резко расчлененный с общей и внутренней сонной артерии.
- Два ЭКА ветви затем резко расчлененный, первый филиал заголовком медиально и второй ветки заголовком боков. Обе ветви обезболивающий укол и вырезать, который позволяет для большего удобства в мобилизации крупных судов.
- ЭКА в настоящее время более расчлененный рострально. Подъязычной кости могут возникнуть, и это будет ограничивать масштабы ростральной рассечение. Наружной сонной артерии связан с дистально, как это возможно, с 6-0 шелковые нити.
- Другой 6-0 шелковых шва помещается свободно вокруг ЭКА возле бифуркации с МКА. Убедитесь, что не закрывают сосуд, как внутрипросветного шов, который будет использоваться для окклюзии будет идти до конца здесь на более позднем этапе.
- Микрохирургическая клипы размещаются на общей и внутренней сонной артерии вблизи бифуркации.
- Начальное парциальное arteriotomy создается между двумя шелковыми шва связи на наружной сонной артерии.
- Ввести 2,2 -3,0 см длиной 4-0 шва нейлона мононити, с изломом см 2,0 от ее округлые, кремния покрытием наконечника, в ЭКА просвет вниз к ОСО где микрохирургических клип находится. Эти швы являются коммерчески доступными (Doccol Corp, Редлендс, штат Калифорния, США). Разрежьте оставшуюся часть ЕЦА (на месте частичного arteriotomy), чтобы освободить пень и положение пень ниже бифуркации ЭКА и ICA, это будет более легко позволяют внутрипросветного шов скатиться в ICA.
- Затяните шелка вокруг шва культи ЭКА для обеспечения внутрипросветного шов нейлона и предотвратить кровотечение, а затем удалить микрососудистых клип из МКА. Открытое клипа медленно, прежде чем снимать ее для проверки кровотечение.
- Продолжите нейлона шва от ЭКА в ICA просвета в средней мозговой артерии (СМА). Эта длина, как правило, 18-20 мм и является причиной для размещения излом шва до установки. После переменной длины из нейлона шов вставляется, сопротивление может ощущаться. Если это произошло с большей частью нейлона шов еще присутствует вне судна, это означает, что шов, скорее всего, ввод крылонебный артерии (см. примечание ниже). Отойдите назад и кривой шов слегка продолжить вдоль ICA, которая будет работать более медиально. Кроме того, рассечение происхождения PPA может быть сделано, чтобы лучше представить себе путьиз внутрипросветный нити. Продолжить, чтобы вставить нейлона шва, пока не почувствуете сопротивление во время и после 2 см изломами позиции. На данный момент, внутрипросветного шов заблокировала начало MCA. MCA окклюзии могут быть подтверждены путем мониторинга уменьшении региональных мозгового кровотока использованием лазерного доплеровского расходомера (см. таблицу материалов для одного оборудования источника). Также отметим, что происхождение крылонебный артерии прочь ICA могут быть непосредственно связаны прочь, если это предпочтительно, для того, чтобы избежать случайного интубации этого судна с внутрипросветный шва.
- Начало таймер и записывать время начала окклюзии.
- Удалить из microclip ОСО.
- Закрыть разрез (дермы, panniculus carnosus, слои подкожной клетчатки) быстро с 3-0 шелковых шва (простой непрерывный узор будет способствовать открытию для реперфузии) и осторожно поместите крысы в клетке восстановления. Проверьте, что клетке пол вокруг носа и рта не содержит существенных постельные принадлежности и контролировать восстановление после наркоза.
Восстановление кровотока СМА (реперфузия)
- Незадолго до окклюзии период должен закончиться, повторно обезболить крысы, продезинфицировать место разреза с Бетадин и 70% этанола (3 циклов, как и раньше) и снова открыть разрез, удалив закрытия швов.
- Место microclip на ОСО, как и раньше.
- Вывод частично окклюзии шва от МКА до конца шва виден через ICA. Не в полной мере удаления от шва ICA / ЭКА!
- Место microclip на ICA выше конца внутрипросветного шва.
- Полностью удалить окклюзии шва и плотно галстук пень ЕЦА. Запись конце окклюзии (реперфузия начала) время.
- Удалить microclip от ICA.
- Удалить из microclip ОСО.
- Смочите регионе несколько капель стерильного физиологического раствора и закрыть разрез слоя (дермы, panniculus carnosus, подкожной клетчатки) с 3-0 шелковых шва с помощью простой прервал узор.
- Администрирование 0,05 мг / кг бупренорфин (или другого соответствующего послеоперационного обезболивающего после вашего институциональных принципов) в брюшную пространства.
- Inject 5cc из нагретого солевой внутрибрюшинно. Это позволит обеспечить гидратацию во время стадии восстановления.
- Монитор восстановления крыс от наркоза.
- После крыс восстановилась, тест на поведенческие указанием миокарда, держа крысу за хвост и наблюдая ли крысы может обернуться для обеих сторон. Свернувшись в одну сторону не ожидается. Простые весы скоринг может быть использован для записи начальный период после инфаркта behavorial функционирования (см. Обсуждение).
- Дополнительное введение бупренорфина (той же дозировке, что и выше) должны быть предоставлены все 6 до 8 часов в течение 24 часов облегчения боли. Расширение обезболивания, если животное демонстрирует признаки дискомфорта.
Представитель Результаты
Рисунок 1. Окклюзия средней мозговой артерии с помощью эндоваскулярных шва. Упрощенная схема черепно системы кровообращения у крыс показано с кремнием покрытием внутрипросветного шов окклюзии происхождения MCA. О. А. и С. ответвляется левого ЭКА были перевязаны и шовный галстук вокруг ЭКА пень держит внутрипросветного шов на месте. ACA, передней мозговой артерии; Б.А., основной артерии; ОСО, общей сонной артерии; ЭКА, наружной сонной артерии; ICA, внутренней сонной артерии; MCA, средней мозговой артерии; О.А., затылочной артерии; СПС, задней мозговой артерии; PComA, задней соединительной артерии; PPA, крылонебный артерии; ST, улучшенные артерии щитовидной железы. Рис адаптировано из Сасаки и др. 4. И Ли 3.
Рисунок 2. Представитель магнитно-резонансной томографии корональных участки мозга крыс через 24 часа после 1 часа переходные MCAO. Отека мозга сопровождающих фокальной ишемии визуализируется в Т2-взвешенной МРТ изображений. Зона инфаркта появляется гиперинтенсивным (яркий) на Т2 изображениях. Аналогичные тенденции инфаркта можно увидеть с более продвинутыми МРТ методы, такие как диффузионно-взвешенных изображений и кажущийся коэффициент диффузии отображение 5.
Рисунок 3. Представитель корональных участков мозга крысы окрашивали TTC 24 часов после 1 часа переходные MCAO. TTC окрашивания показывает белый (неокрашенных) инфаркта областей коры головного мозга и полосатого тела в том же крыса, как показано на рисунке 2. Обратите внимание, что общая картина координационного ишемических поражений похож на таковой у МРТ Т2-взвешенных изображениях, хотя последняя область инфаркта определяется гистологически может быть немного меньше, чем T2 поражения.
Discussion
Грызун модели ишемии головного мозга могут быть классифицированы как глобальные или координационные и как обратимым или необратимым. Мы используем обратимым координационного модели ишемии, чтобы подражать реперфузионного повреждения, которые могут произойти после реканализации в человеческих пациентов, перенесших инсульт. Хотя крысы акций преимущество подобных черепных обращение к человеческой, обширные внутричерепного коллатерального кровообращения из-за Круг Уиллис и лептоменингеальных результаты анастомозов в несовместимым объемы миокарда 6. Мы используем спонтанно гипертензивных крыс (SHR) пределе, потому что размер инфаркта выше в SHRs подвергается координационного ишемии головного мозга по сравнению с нормальным артериальным давлением крыс 7-10. Инсульт индукции в SHRs также более последовательной и может генерировать меньше смертности, чем в других часто используемых штаммов 11. Кроме того, физиологические параметры должны быть проверены всей операции, потому что флуктуации могут добавить к изменчивости инфаркт томов; эти параметры включают в себя артериальное давление, артериальная O 2 и CO 2 уровня, гипотермия, и гипергликемии, что может усугубить ишемическое повреждение 2,12 . Переохлаждение вызывает особую озабоченность, поскольку он может уменьшить степень ишемического повреждения нейронов и, следовательно, помещая крысу в терморегуляции грелку во время операции имеет важное значение.
Мы используем коммерчески подготовленные кремния покрытием швы в этой процедуре, в попытке увеличить согласованность размеров инфаркта 13-15. Традиционно внутрипросветный швы используются для окклюзии СМА были подготовлены пламени округления 3-0 нейлона наконечник шва или с использованием горячего клея пушки, чтобы покрыть шов наконечник с небольшой шарик клея 16. Эти процедуры производят швов с различными диаметрами наконечник и, таким образом, может потребоваться несколько попыток, прежде чем найти окклюзии шов, который соответствует диаметр сосуда данного крысы. Дополнительные вариации на MCAO метод, описанный в этом видео включать больше дистальной окклюзии, не щадя lenticulostriate ветви, чтобы иметь чистые корковых инфаркта 17, и одновременные окклюзии СМА и ипсилатеральной общей сонной артерии, чтобы уменьшить коллатерального кровотока 6,9.
Функциональных последствий инсульта можно оценить, используя различные поведенческие тесты, в которых дефицит в конкретные задачи отражены в простая шкала оценки. Например, Bederson и соавт. 18 развитых неврологических крыс классификации балл по степени сгибания лапы в повышенных положение тела, асимметричные устойчивость к боковой толчок, и в открытом грунте кружили поведения. Крысы расширения как передние конечности на пол, когда повышенный и экспонирования нет другого дефицита были классифицированы "Normal (0)", тогда как крысы с контралатеральной лапы сгибание только были классифицированы с "Умеренный дефицит (1)". "Тяжелая 2 степени" крыс отображается снизилась сопротивления на противоположной стороне, чтобы боковые силы и "Тяжелая степень 3" крыс дополнительно занимается кружили поведения. Нижняя оценка поведенческих дефицитов всегда наблюдается в следующем более высокого класса (например, класса 2 и 3 животных также отображается передних конечностей сгибание), и эти оценки были прогнозировать различия в размер инфаркта 18. Таким образом, такой простой системы скоринга позволяет быстро, в соответствии полуколичественной оценки функционального дефицита от инсульта.
Измерение степени инфаркт мозга обычно осуществляется гистологическое окрашивание на повреждение ткани использованием ТТК, крезиловый фиолетового (Нисслю пятно) или гематоксилином и эозином. Магнитно-резонансная томография методы, включая диффузионно-взвешенной МРТ для визуализации миокарда на ранних моментов времени после окклюзии, позволяет для определения объема инфаркта в каждой отдельной крысы, без необходимости для уборки ткани. Это особенно ценно в исследованиях, направленных на определение эффективности нейропротекторное лечение после инсульта, визуализация крыс после MCAO но до начала лечения администрация дает следователю уверенность, что все экспериментальные и контрольные животные испытали на себе подобные удары, чтобы начать, уменьшая смешанных последствий изменчивости В ход индукции.
Disclosures
Авторы не имеют противоположные интересы раскрывать.
Этот протокол был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета в Университете Висконсин-Мэдисон школы медицины и общественного здравоохранения и соблюдает Национального института здоровья руководящих принципов для использования подопытных животных.
Acknowledgments
Мы благодарим Beth Рауха и университета Висконсина Малый фонда изображениями животных для магнитно-резонансной томографии. Департамент Неврологические хирургии в Университете Висконсин-Мэдисон предоставило финансирование для этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon suture | Doccol Corporation | 2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter | |
| Spontaneously hypertensive rats | Charles River Laboratories | 290-300 g, male | |
| Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads | Gaymar Industries | ||
| Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit | Summit Hill Laboratories | ||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | CellPoint Scientific | ||
| Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor | TSI Inc. |
References
- van Gijn, J., Dennis, M. S. Issues and answers in stroke care. Lancet. 352, Suppl 3. SIII23-27 (1998).
- Macrae, I. M. New models of focal cerebral ischaemia. British Journal of Clinical Pharmacology. 34, 302-302 (1992).
- Lee, R. M. Morphology of cerebral arteries. Pharmacol Ther. 66, 149-173 (1995).
- Sasaki, M., Honmou, O., Kocsis, J. D. A rat middle cerebral artery occlusion model and intravenous cellular delivery. Methods Mol Biol. 549, 187-195 (2009).
- Bråtane, B. T., Bastan, B., Fisher, M., Bouley, J., Henninger, N. Ischemic lesion volume determination on diffusion weighted images vs. apparent diffusion coefficient maps. Brain Res. 1279, 182-188 (2009).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Dogan, A., Başkaya, M. K., Rao, V. L., Rao, A. M., Dempsey, R. J. Intraluminal suture occlusion of the middle cerebral artery in Spontaneously Hypertensive rats. Neurol Res. 20, 265-270 (1998).
- Ogata, J., Fujishima, M., Morotomi, Y., Omae, T. Cerebral infarction following bilateral carotid artery ligation in normotensive and spontaneously hypertensive rats: a pathological study. Stroke. 7, 54-60 (1976).
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
- Duverger, D., MacKenzie, E. T. The quantification of cerebral infarction following focal ischemia in the rat: influence of strain, arterial pressure, blood glucose concentration, and age. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 449-461 (1988).
- Coyle, P. Different susceptibilities to cerebral infarction in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Sprague-Dawley rats. Stroke. 17, 520-525 (1986).
- Slivka, A. P. Hypertension and hyperglycemia in experimental stroke. Brain Res. 562, 66-70 (1991).
- Bouley, J., Fisher, M., Henninger, N. Comparison between coated vs. uncoated suture middle cerebral artery occlusion in the rat as assessed by perfusion/diffusion weighted imaging. Neurosci Lett. 412, 185-190 (2007).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156, 161-165 (2006).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical neurology. 24, 47-51 (1985).
- Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
