Summary
Kirurgisk induktion av ischemisk hjärnskada hos råtta är en allmänt använd modell för stroke forskning. Här kan vi visa på induktion av fokal cerebral ischemi av ocklusion av mellersta cerebral artär. Visualisering av den resulterande infarkt genom histologisk färgning och magnetisk resonanstomografi visas också.
Abstract
Stroke är den vanligaste orsaken till handikapp och den tredje vanligaste dödsorsaken hos vuxna över hela världen 1. I mänskliga stroke, det finns en mycket varierande kliniska tillstånd, i utvecklandet av djurmodeller av fokal ischemi dock åstadkomma reproducerbarhet experimentellt inducerad infarkt volym är viktigt. Råttan är en allmänt använd djurmodell för stroke på grund av dess relativt låga kostnader djurhållning och att likheten mellan den kraniella omsättning till att människor 2,3. Hos människa är den mellersta cerebral artär (MCA) oftast drabbas vid stroke syndrom och flera metoder för MCA ocklusion (kortex) har beskrivits för att efterlikna detta kliniska syndrom i djurmodeller. Eftersom recanalization ofta uppstår efter en akut stroke i det mänskliga, reperfusion efter en period av ocklusion har varit med i många av dessa modeller. I denna video visar vi den övergående endovaskulära sutur kortex modell i spontant hypertensiva råttor (SHR). En glödtråd med en kisel spets beläggning läggs intraluminally på MCA ursprung för 60 minuter, följt av reperfusion. Observera att den optimala ocklusion kan variera i andra råtta stammar, såsom Wistar eller Sprague-Dawley. Flera beteendemässiga indikatorer för stroke på råtta visas. Fokal ischemi bekräftas med hjälp av T2-viktad magnetisk resonanstomografi bilder och genom färgning hjärnan avsnitt med 2,3,5-triphenyltetrazolium klorid (TTC) 24 timmar kortex.
Protocol
Kortex Rat Model
Prekirurgisk Förberedelser
Aseptisk teknik skall användas för alla överlevnad kirurgiska ingrepp. Desinficera den kirurgiska arbetsytan med kommersiella desinfektionsmedel och förbereda sterila kirurgiska förpackningar av instrument, draperier, gasbinda, kompresser, suturer och skalpell blad i autoklav. En kirurgisk mask, hår motorhuv och sterila handskar. En Germinator torr pärla autoklav används också för att omsteriliseras kirurgiska instrument mellan förfaranden om flera råtta operationer kommer att ske under en session. Prewarm en vattenmantlad homeothermic filt och rum under en absorberande dyna för att förhindra hypotermi av råtta under operation.
- Placera spontant hypertensiva råttor (eller andra råtta stam val) till en induktion kammaren och inducera anestesi med 5% isofluran (anestesiapparaten bör sättas till 1,0 l / min O 2 och 1,0 l / min N 2 O). Sänk till 1-2% isofluran att upprätthålla anestesi.
- Applicera artificiella tårar salva i båda ögonen.
- Raka halsen och vänster halsregionen bortom blivande snitt webbplatsen med Clippers (Oster A5 med # 10 blad).
- Applicera Betadine på en kompress och desinficera huden från mitten av kirurgiska regionen spiral utåt. Skölj med steril gasväv som innehåller 70% etanol, flytta block i ett liknande mönster. Upprepa både steg för totalt tre cykler.
- Injicera 0,2 ml 0,5% bupivakain subkutant längs den blivande snitt webbplatsen.
- Placera råttan i steril slätst eller täck med en steril kirurgisk drapera.
Övergående ocklusion av MCA
- Enligt ett operativsystem mikroskop, är en ventral mittlinjen snitt utföras och de ytliga fascia är dissekeras.
- Under den ytliga fascia, det finns körtelvävnad till vänster och tre muskler som bildar en triangel: de sternohyoid, som ligger mittlinjen över luftstrupen, den digastric (lätt identifieras med sin skinande vita tendinous portion), och slutligen, i sternocleidomastoideus musklerna.
- Noggrann skarpa och dissektion sker inom triangeln för att identifiera halspulsådern (exklusive dissektion kan föredras av vissa att oavsiktligt vävnadsskada). Den externa, interna och gemensamma halspulsåder (ECA, ICA, CCA) är utsatta för. Halspulsådern är stort och synligt pulser. Vagusnerven ses Coursing längs laterala delen av både gemensamma och interna halspulsåder och är kraftigt dissekeras av de gemensamma och interna halspulsåder.
- Två ECA grenar sedan dissekeras kraftigt, den första grenen rubriken medialt och den andra grenen rubriken sidled. Båda grenarna är flamberats och skär, vilket möjliggör större lätthet i att mobilisera större fartyg.
- ECA är nu dissekeras mer rostrally. Den tungbenet kan påträffas och detta kommer att begränsa omfattningen av rostralt dissekering. Den yttre halspulsådern är bunden av så distalt som möjligt med en 6-0 silke sutur.
- En annan 6-0 silke sutur placeras löst runt revisionsrätten nära bifurkationen med ICA. Se till att inte täppa till fartyget som intraluminal suturen som ska användas för ocklusion kommer att gå igenom här i ett senare steg.
- Mikrokirurgisk klipp är placerade på gemensamma och interna halspulsåder nära bifurkation.
- En första del arteriotomy skapas mellan de två banden siden sutur på den yttre halspulsådern.
- Inför en 2,2 -3,0 cm längd 4-0 monofilamentgarn nylon suturer och med en knut 2,0 cm från den rundade, kisel-belagd spets, till revisionsrätten lumen ner mot CCA där mikrokirurgisk klippet finns. Dessa suturer finns kommersiellt tillgängligt (Doccol Corp, Redlands, Kalifornien, USA). Skär den återstående delen av ECA (på platsen för den partiella arteriotomy) att befria stubbe och placera stubben under bifurkation av revisionsrätten och ICA, vilket kommer att lättare låta intraluminal suturen att glida in på ICA.
- Dra åt siden sutur runt revisionsrätten stubbe för att säkra intraluminal nylon suturen och förhindra blödning, och ta sedan bort mikrovaskulära klippet från ICA. Öppna klämman långsamt innan du tar bort den för att kontrollera blödning.
- Fortsätt att föra fram nylon sutur från revisionsrätten till ICA lumen till mitten cerebral artär (MCA). Denna längd är vanligtvis 18-20 mm och är anledningen till att placera en knut i suturen innan insättningen. Efter en variabel längd av nylon sutur sätts, kan motstånd kännas. Om detta inträffar med mycket av nylon sutur kvar utanför fartyget, betyder det att suturen troligen går in i pterygopalatine artären (se nedan). Dra tillbaka och kurva suturen något att fortsätta på ICA, som kommer att köra mer medialt. Dessutom kan dissekering av ursprung PPA göras för att bättre visualisera den vägav intraluminal glödtråden. Fortsätt att sätta in nylon suturen tills ett motstånd känns vid och efter 2 cm böjd position. På denna punkt har intraluminal sutur blockerade ursprung MCA. MCA ocklusion kan bekräftas genom att övervaka minskningen av regionala cerebrala blodflödet med hjälp av en laser Doppler flödesmätare (se Material tabell för en utrustning källa). Observera också att ursprunget till pterygopalatine artär bort av ICA direkt kan kopplas bort, om så önskas, för att undvika oavsiktlig intubering av detta fartyg med intraluminal sutur.
- Starta timern och spela in ocklusion starttid.
- Ta bort microclip från CCA.
- Stäng snittet (dermis, panniculus carnosus, subkutan vävnad lager) snabbt med 3-0 silke sutur (en enkel sammanhängande mönster kommer att underlätta återupptagandet av reperfusion) och försiktigt placera råtta i en återhämtning bur. Kontrollera att burgolvet runt näsa och mun är fria från strö och övervaka återhämtning från narkosen.
Restaurering av MCA blodflöde (reperfusion)
- Strax innan ocklusion period bör därför åter söva råttan, desinficera snittet webbplats med Betadine och 70% etanol (3 cykler, som tidigare) och öppna snittet genom att ta bort den avslutande suturer.
- Placera en microclip på CCA, som tidigare.
- Dra ut halvvägs blockerade sutur från ICA till suturen slutet syns genom ICA. Inte helt bort sutur från ICA / ECA!
- Placera en microclip på ICA ovanför slutet av intraluminal sutur.
- Helt ta bort blockerade suturen och tätt fästa revisionsrättens stubben. Rekord i slutet av ocklusion (reperfusion start) tid.
- Ta bort microclip från ICA.
- Ta bort microclip från CCA.
- Fukta området med några droppar steril koksaltlösning och nära snittet lager (dermis, panniculus carnosus, subkutan vävnad) med 3-0 siden sutur med en enkel avbruten mönster.
- Administrera 0,05 mg / kg buprenorfin (eller annan lämplig postoperativ smärtlindring efter din institutionella riktlinjer) i peritoneal rymden.
- Injicera 5cc av uppvärmd saltlösning intraperitonealt. Detta kommer att ge fukt under återhämtningen scenen.
- Övervaka återvinning av råtta från anestesi.
- När råttan har återhämtat sig, test för beteendemässiga tecken på hjärtinfarkt genom att hålla råttan i svansen och observera om råttan kan vända sig till båda sidor. Curling till en sida förväntas. Enkla poäng skalor kan användas för att spela in tidiga post-infarkt behavorial fungerar (se diskussion).
- Ytterligare injektioner av buprenorfin (samma dosering som ovan) bör ges var 6 till 8 timmar för 24 tim för smärtlindring. Förläng analgesi om djuret visar tecken på obehag.
Representativa resultat
Figur 1. Ocklusion av mellersta cerebral artär av endovaskulärt suturer. En förenklad bild av kraniella cirkulationssystemet av råtta visas med en kisel-belagd intraluminal sutur blockerade ursprung MCA. OA och grenar ST stänga av vänster ECA har knyts ihop och en sutur slips runt revisionsrätten stubben håller intraluminal sutur på plats. ACA, främre cerebral artär, BA, basilaris artär, CCA, gemensamma halspulsådern, ECA, yttre halspulsådern, ICA, carotis interna, MCA, mitten cerebral artär, OA, occipital artär, PCA, posterior cerebral artär, PComA, bakre kommunicera artär, PPA, pterygopalatine artär, ST, överlägsen sköldkörtel artär. Figur anpassat från Sasaki et al. 4 och Lee 3.
Figur 2. Representant magnetisk resonanstomografi av koronalt avsnitt av 24 råtthjärna timmar efter 1 timme övergående kortex. Hjärnödem medföljande fokal ischemi visualiseras i T2-viktade MRT bilder. Den infarkt zon visas hyperintensiva (ljus) på T2 bilder. Liknande infarkt mönster kan ses med mer avancerade MR-tekniker som diffusion-viktade bilder och skenbar diffusionskoefficient kartläggning 5.
Figur 3. Representant koronalt delar av råtthjärna färgas med TTC 24 timmar efter 1 timme övergående kortex. TTC färgning avslöjar vita (ofärgade) infarktområdet regioner i hjärnbarken och striatum i samma råtta som visas i figur 2. Observera att det allmänna mönstret av fokala ischemiska lesioner liknar den som ses i MRT T2-viktade bilder, även om den slutliga infarkt fastställda arealen histologiskt kan vara något mindre än T2 lesion.
Discussion
Gnagarmodeller av cerebral ischemi kan klassificeras som globala eller fokala och som reversibel eller irreversibel. Vi använder en reversibel fokus ischemi modellen för att efterlikna reperfusion skada som kan uppstå efter recanalization i mänskliga strokepatienter. Medan råttan delar nytta av liknande kraniell cirkulationen till den mänskliga, den omfattande intrakraniell säkerheter cirkulation på grund av Circle of Willis och leptomeningeal anastomoser resulterar i inkonsekvent infarkt volymer 6. Vi använder spontant hypertensiva råttor (SHR) stam eftersom infarkt storlek är större i SHRs utsätts för fokal cerebral ischemi jämfört med normotensiva råttor 7-10. Stroke induktion i SHRs är också mer konsekvent och kan generera lägre dödlighet än i andra vanliga stammar 11. Dessutom bör fysiologiska parametrar övervakas under hela operationen, eftersom variationer kan lägga till variationen i infarkt volymer, dessa parametrar är blodtryck, arteriella O 2 och CO 2 nivåer, hypotermi, och hyperglykemi, vilket kan förvärra ischemisk skada 2,12 . Hypotermi är särskilt oroande eftersom det kan minska graden av neuronala ischemisk skada, och därför placera råttan på en värmeregleringssystemen värmedyna under operation är nödvändig.
Vi sysselsätter kommersiellt beredd kisel-belagda suturer i detta förfarande i ett försök att öka samstämmigheten i infarkt storlek 13-15. Traditionellt har intraluminal suturer används för att täppa till MCA beretts av eld-avrundning en 3-0 nylon sutur spets eller med hjälp av en limpistol att belägga suturen spetsen med en liten lim pärla 16. Dessa förfaranden ger suturerna med varierande spets diametrar och därmed kan kräva flera försök till ocklusion innan du hittar en sutur som matchar fartyget diametern på en given råtta. Ytterligare variationer på kortex metod som beskrivs i den här videon innehålla mer distal ocklusion och skonar lenticulostriate grenarna för att få en ren kortikal infarkt 17, och samtidig ocklusion av MCA och ipsilaterala gemensamma halspulsådern för att minska flödet säkerhet blod 6,9.
De funktionella effekterna av stroke kan bedömas med hjälp av olika beteende-tester, där underskotten i specifika uppgifter återspeglas i en enkel poäng skala. Till exempel utvecklat Bederson et al. 18 en neurologisk råttor poäng graderingen på omfattningen av forelimb flexion i ett högt kroppsställning, asymmetrisk motstånd mot en lateral skjuta och öppna fält cirklande beteende. Råttor sträcker båda frambenen på golvet när förhöjda och uppvisar inga andra underskott bedömdes "Normal (0)", medan råttor med kontralaterala forelimb flexion bara klassades med "Måttlig underskott (1)". "Svår klass 2" råttor visas minskat motstånd på den kontralaterala sidan till en lateral kraft och "Svår klass 3" råttor dessutom engagerade i cirklar beteenden. Lägre grad beteendestörningar var alltid observerats i en högre grad (t.ex. grad 2 och 3 djur också visas forelimb böjning) och dessa poäng var prediktiva för skillnader i infarkt storlek 18. Således kan en sådan enkel poängsystem för en snabb och konsekvent semikvantitativ bedömning av den funktionella underskotten från stroke.
Mätning av omfattningen av hjärninfarkt är ofta uppnås genom histologiska färgning för vävnadsskador med TTC, Cresyl violett (Nissl fläcken) eller hematoxylin och eosin. Magnetisk resonanstomografi tekniker, bl.a. spridning-viktad MRT för att visualisera infarkt vid tidigt tidpunkter efter ocklusion, låt för bestämning av en infarkt volym i varje enskild råtta utan behov av avverkning vävnad. Detta är särskilt värdefullt i studier som syftar till att fastställa effekten av en nervskyddande behandling efter stroke, bildbehandling råtta efter kortex men före behandling administrationen ger utredaren förtroende för att alla experiment och kontrollera djur upplevt liknande slag för att starta, minska förbryllande effekter av variabilitet vid stroke induktion.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen att lämna ut.
Detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Wisconsin-Madison School of Medicine och folkhälsa och står fast vid National Institutes of Health riktlinjer för användningen av försöksdjur.
Acknowledgments
Vi tackar Beth Rauch och University of Wisconsin Small Animal Imaging Facility för magnetisk resonanstomografi. Institutionen för neurokirurgi vid University of Wisconsin-Madison finansierat detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon suture | Doccol Corporation | 2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter | |
| Spontaneously hypertensive rats | Charles River Laboratories | 290-300 g, male | |
| Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads | Gaymar Industries | ||
| Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit | Summit Hill Laboratories | ||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | CellPoint Scientific | ||
| Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor | TSI Inc. |
References
- van Gijn, J., Dennis, M. S. Issues and answers in stroke care. Lancet. 352, Suppl 3. SIII23-27 (1998).
- Macrae, I. M. New models of focal cerebral ischaemia. British Journal of Clinical Pharmacology. 34, 302-302 (1992).
- Lee, R. M. Morphology of cerebral arteries. Pharmacol Ther. 66, 149-173 (1995).
- Sasaki, M., Honmou, O., Kocsis, J. D. A rat middle cerebral artery occlusion model and intravenous cellular delivery. Methods Mol Biol. 549, 187-195 (2009).
- Bråtane, B. T., Bastan, B., Fisher, M., Bouley, J., Henninger, N. Ischemic lesion volume determination on diffusion weighted images vs. apparent diffusion coefficient maps. Brain Res. 1279, 182-188 (2009).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Dogan, A., Başkaya, M. K., Rao, V. L., Rao, A. M., Dempsey, R. J. Intraluminal suture occlusion of the middle cerebral artery in Spontaneously Hypertensive rats. Neurol Res. 20, 265-270 (1998).
- Ogata, J., Fujishima, M., Morotomi, Y., Omae, T. Cerebral infarction following bilateral carotid artery ligation in normotensive and spontaneously hypertensive rats: a pathological study. Stroke. 7, 54-60 (1976).
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
- Duverger, D., MacKenzie, E. T. The quantification of cerebral infarction following focal ischemia in the rat: influence of strain, arterial pressure, blood glucose concentration, and age. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 449-461 (1988).
- Coyle, P. Different susceptibilities to cerebral infarction in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Sprague-Dawley rats. Stroke. 17, 520-525 (1986).
- Slivka, A. P. Hypertension and hyperglycemia in experimental stroke. Brain Res. 562, 66-70 (1991).
- Bouley, J., Fisher, M., Henninger, N. Comparison between coated vs. uncoated suture middle cerebral artery occlusion in the rat as assessed by perfusion/diffusion weighted imaging. Neurosci Lett. 412, 185-190 (2007).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156, 161-165 (2006).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical neurology. 24, 47-51 (1985).
- Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
