Summary
Chirurgische inductie van ischemische hersenschade in de rat is een veel gebruikt model voor een beroerte onderzoek. Hier laten we zien de inductie van focale cerebrale ischemie door occlusie van de midden cerebrale slagader. Visualisatie van de resulterende infarct door histologische kleuring en magnetische resonantie beeldvorming wordt ook getoond.
Abstract
Beroerte is de belangrijkste oorzaak van invaliditeit en de derde belangrijke doodsoorzaak bij volwassenen wereldwijd 1. In de menselijke beroerte, bestaat er een zeer variabel klinische toestand, in de ontwikkeling van dierlijke modellen van focale ischemie, echter, het bereiken van de reproduceerbaarheid van experimenteel geïnduceerde infarct volume is essentieel. De rat is een veel gebruikt diermodel voor beroerte als gevolg van de relatief lage kosten van de veehouderij en de gelijkenis van zijn schedel circulatie naar dat van de mens 2,3. Bij de mens, de middelste hersenslagader (MCA) is het meest beïnvloed in een beroerte syndromen en meerdere methoden van MCA occlusie (MCAO) zijn beschreven om dit klinisch syndroom na te bootsen in diermodellen. Omdat rekanalisatie meestal optreedt na een acute beroerte in de mens, reperfusie na een periode van occlusie is opgenomen in veel van deze modellen. In deze video, tonen we de voorbijgaande endovasculaire hechting MCAO model in de spontaan hypertensieve rat (SHR). Een filament met een siliconen coating tip is intraluminally geplaatst bij de MCA oorsprong gedurende 60 minuten, gevolgd door reperfusie. Merk op dat de optimale occlusie periode kan variëren in andere rat stammen, zoals Wistar of Sprague-Dawley. Een aantal gedragsindicatoren van een beroerte in de rat worden weergegeven. Focale ischemie wordt bevestigd met behulp van T2-gewogen magnetische resonantie beelden en door kleuren hersenen secties met 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 24 uur na MCAO.
Protocol
MCAO Rat Model
Pre-operatieve Voorbereidingen
Aseptische techniek moet worden gebruikt voor alle te overleven chirurgische procedures. Ontsmet de chirurgische werkvlak met commerciële ontsmettingsmiddel en voor te bereiden steriele chirurgische verpakkingen van instrumenten, gordijnen, gaas, wattenstaafjes, hechtingen, en scalpelmesjes de autoclaaf. Een chirurgisch masker, haar muts en steriele handschoenen worden gedragen. Een Germinator droge kraal sterilisator wordt ook gebruikt voor chirurgische instrumenten tussen de procedures opnieuw steriliseren als er meerdere rat operaties zullen worden uitgevoerd tijdens een sessie. Voorverwarmen een watermantel homeothermic deken en plaats onder een absorberend kussen om onderkoeling van de rat te voorkomen dat tijdens de operatie.
- Plaats spontaan hypertensieve rat (of een andere rat stam naar keuze) in een inductie-kamer en veroorzaken anesthesie met 5% isofluraan (anesthesie machine moet worden ingesteld op 1,0 L / min O 2 en 1,0 L / min N 2 O). Te verlagen tot 1-2% isofluraan anesthesie te onderhouden.
- Pas kunstmatige tranen zalf aan beide ogen.
- Scheer de keel en liet de nek gebied buiten de aspirant-incisie site met behulp van clippers (Oster A5 met # 10 blad).
- Betadine van toepassing op een gaasje en desinfecteer de huid vanaf het midden van de chirurgische regio, spiraalsgewijs naar buiten. Spoelen met steriel gaasje met 70% ethanol, het verplaatsen pad in een vergelijkbaar patroon. Herhaal beide stappen voor een totaal van drie cycli.
- Injecteer 0,2 ml van 0,5% bupivacaïne subcutaan langs de toekomstige incisie site.
- Plaats rat in steriele tricotsteek of bedekken met een steriel chirurgisch laken.
Voorbijgaande verstopping van MCA
- Onder een operationele microscoop, is een ventrale middellijn incisie uitgevoerd en de oppervlakkige fascia wordt ontleed.
- Onder de oppervlakkige fascia, is er klierweefsel aan de linkerkant en drie spieren die een driehoek vormen: de sternohyoid, die ligt middellijn over de luchtpijp, de kauw (gemakkelijk te herkennen met zijn glanzend witte tendineuze deel), en ten slotte, de musculus sternocleidomastoideus spier.
- Zorgvuldige scherpe en stompe dissectie wordt uitgevoerd binnen de driehoek aan de halsslagader (exclusief stompe dissectie kan de voorkeur door sommigen gezien als toevallige weefsel schade te minimaliseren) te identificeren. De externe, interne, en de gemeenschappelijke halsslagaders (ECA, ICA, CCA) worden blootgesteld. De halsslagader is groot en zichtbaar pulsen. De nervus vagus wordt gezien coursing langs de laterale aspect van zowel de gemeenschappelijke en interne carotis slagaders en wordt scherp ontleed uit de gemeenschappelijke en de interne halsslagaders.
- Twee ECA takken worden dan scherp ontleed, de eerste tak rubriek mediaal en de tweede tak kop zijwaarts. Beide takken zijn dichtgeschroeid en gesneden, die zorgt voor meer gemak in het mobiliseren van de grotere schepen.
- De ECA is nu meer rostraal ontleed. Het tongbeen kunnen worden geconfronteerd en dit zal de omvang van de rostrale dissectie te beperken. De externe halsslagader wordt afgehecht zo distaal mogelijk met een 6-0 zijden hechtdraad.
- Nog een 6-0 zijden hechtdraad is losjes geplaatst rond de Europese Rekenkamer bij de splitsing met de ICA. Zorg ervoor dat u het schip af te sluiten als de intraluminale hechtingen te worden gebruikt voor de occlusie zal worden gaan door hier op een later stap.
- Microchirurgische clips worden geplaatst op gemeenschappelijke en interne halsslagaders de buurt van de bifurcatie.
- Een eerste gedeeltelijke arteriotomie wordt gecreëerd tussen de twee zijden hechtdraad banden op de externe halsslagader.
- Introduceer een 2,2 -3,0 cm lengte van 4-0 monofilament nylon hechtdraad, met een knik 2,0 cm uit de ronde, silicium-coating tip, in de ECA lumen naar beneden richting de CCA, waar de microchirurgische clip zich bevindt. Deze hechtingen zijn commercieel verkrijgbaar (Doccol Corp, Redlands, CA, USA). Snijd het resterende deel van de Rekenkamer (op de plaats van de partiële arteriotomie) om de stomp en de positie van de stomp onder de splitsing van de Rekenkamer en ICA vrij, dit zal gemakkelijker kan de intraluminale hechting te schuiven in de ICA.
- Draai de zijden hechtdraad rond de Europese Rekenkamer stomp aan de intraluminale nylon hechtdraad veilige en bloeden te voorkomen, en dan de microvasculaire clip van de ICA te verwijderen. Open langzaam de clip alvorens deze te verwijderen om te controleren op bloeden.
- Ga door het bevorderen van de nylon hechtdraad van de Rekenkamer om ICA lumen naar het midden cerebrale slagader (MCA). Deze lengte is meestal 18-20 mm en is de reden voor het plaatsen van een knik in de hechtdraad voorafgaand aan de insertie. Na een variabele lengte van nylon hechtdraad is geplaatst, kan weerstand worden gevoeld. Als dit gebeurt met veel van de nylon hechtdraad nog steeds aanwezig buiten het vat, betekent dit dat de hechtdraad waarschijnlijk is het pterygopalatine slagader binnenkomen (zie toelichting hieronder). Terugtrekken en de curve van de hechtdraad licht om verder te gaan langs de ICA, dat zal meer mediaal lopen. Daarnaast kan dissectie van de oorsprong van de PPA worden gedaan om beter te visualiseren het padvan de intraluminale gloeidraad. Ga verder naar de nylon hechtdraad insert totdat u weerstand voelt tijdens en na het 2 cm geknikte positie. Op dit punt heeft de intraluminale hechting blokkeerde de oorsprong van het MCA. MCA occlusie kan worden bevestigd door het toezicht op de vermindering van de regionale cerebrale doorbloeding met behulp van een laser Doppler flowmeter (zie ook Materiaal tabel voor een apparatuur bron). Merk ook op dat de oorsprong van de pterygopalatine slagader off van de ICA kan direct worden afgebonden, indien gewenst, om per ongeluk intubatie van dit schip met de intraluminale hechting te voorkomen.
- Start de timer en registreren occlusie starttijd.
- Haal de microclip van de CCA.
- Sluit de incisie (dermis, panniculus carnosus, onderhuids weefsel lagen) al snel met 3-0 zijden hechtdraad (een eenvoudige continue patroon zal vergemakkelijken heropening voor reperfusie) en voorzichtig de rat in een kooi herstel. Controleer of de kooi vloer rondom de neus en mond vrij zijn van strooisel en monitor herstel van anesthesie.
Restauratie van MCA bloedstroom (reperfusie)
- Kort voor de occlusie periode moet het einde, opnieuw verdoven van de rat, ontsmet de incisie site met Betadine en 70% ethanol (3 cycli, zoals voorheen) en de heropening van de incisie door het verwijderen van de hechtingen sluiten.
- Plaats een microclip op het CCA, zoals voorheen.
- Trek de afsluitende hechtdraad voortijdig uit de ICA tot de hechting einde is zichtbaar door het ICA. NIET volledig te verwijderen van de hechtdraad uit de ICA / Rekenkamer!
- Plaats een microclip op het ICA boven het einde van de intraluminale hechtdraad.
- Volledig verwijderen van de afsluitende hechtdraad en strak afhechten van de Europese Rekenkamer stomp. Record einde van de occlusie (reperfusie start) tijd.
- Haal de microclip van de ICA.
- Haal de microclip van de CCA.
- Bevochtig de regio met enkele druppels steriele zoutoplossing en sluit de incisie lagen (dermis, panniculus carnosus, onderhuids weefsel) met 3-0 zijden hechtdraad met behulp van een eenvoudige onderbroken patroon.
- Dien 0,05 mg / kg buprenorfine (of een andere geschikte post-operatieve pijnstillende naar aanleiding van uw institutionele richtlijnen) in de peritoneale ruimte.
- Injecteer 5cc van de voorverwarmde zoutoplossing intraperitoneaal. Dit zal hydratatie tijdens de herstelfase.
- Monitor herstel van de rat van de anesthesie.
- Nadat de rat is hersteld, test voor gedragsverandering indicatie van infarct door houden van de rat bij de staart en het observeren van de vraag of de rat kan draaien naar beide kanten. Curling aan slechts een zijde wordt verwacht. Eenvoudig scoren schalen kunnen gebruikt worden om de eerste post-infarct gedragsverandering functioneren record (zie Discussie).
- Extra injecties van buprenorfine (dezelfde dosering als hierboven) moet worden toegediend om de 6 tot 8 uur voor 24 uur van pijnbestrijding. Uit te breiden analgesie als het dier vertoont tekenen van ongemak.
Representatieve resultaten
Figuur 1. Occlusie van de midden cerebrale slagader door endovasculaire hechtdraad. Een vereenvoudigd schema van het craniale bloedsomloop van de rat is getoond met een siliconen-coating intraluminale hechting afsluiter de oorsprong van het MCA. De OA-en ST-takken af van de linker-Europese Rekenkamer zijn geligeerd en een hechtdraad band rond de Europese Rekenkamer stomp houdt de intraluminale hechting op zijn plaats. ACA, anterior cerebrale slagader, BA, basilaire slagader, CCA, gemeenschappelijke halsslagader, de Europese Rekenkamer, de externe halsslagader, ICA, interne halsslagader, MCA, midden cerebrale slagader, OA, achterhoofdsknobbel slagader, PCA, posterior cerebrale slagader, PComA, posterior communiceren slagader, PPA, pterygopalatine slagader, ST, superieure schildklier slagader. Figuur overgenomen uit Sasaki et al.. 4 en Lee 3.
Figuur 2. Vertegenwoordiger van magnetische resonantie beeldvorming van coronale delen van de hersenen van de rat 24 uur na een uur van voorbijgaande aard MCAO. Hersenoedeem bij focale ischemie is gevisualiseerd in T2-gewogen MRI-beelden. Het infarct zone verschijnt hyperintense (helder) op T2 beelden. Vergelijkbare patronen infarct kan gezien worden met meer geavanceerde MRI-technieken zoals diffusie-gewogen beeldvorming en schijnbare diffusiecoëfficiënt in kaart brengen van 5.
Figuur 3. Vertegenwoordiger coronale delen van hersenen van de rat gekleurd met TTC 24 uur na een uur van voorbijgaande aard MCAO. TTC vlekken onthult wit (ongekleurd) infarctgebied regio's van de cerebrale cortex en het striatum in dezelfde rat als die weergegeven in figuur 2. Merk op dat het algemene patroon van focale ischemische letsels is vergelijkbaar met die in de MRI T2-gewogen beelden, hoewel de uiteindelijke bepaald infarctgebied histologisch kan iets kleiner zijn dan de T2 laesie.
Discussion
Knaagdiermodellen van cerebrale ischemie kan worden geclassificeerd als algemene of centrale en als omkeerbaar of onomkeerbaar. We maken gebruik van een omkeerbare focale ischemie model om de reperfusie schade dat na rekanalisatie kunnen voorkomen in menselijke patiënten met een beroerte na te bootsen. Terwijl de rat aandelen in het voordeel van vergelijkbare craniaal circulatie naar de mens, de uitgebreide intracraniële collaterale circulatie als gevolg van de Cirkel van Willis en leptomeningeale anastomosen resulteert in een inconsistente infarct volume 6. We maken gebruik van de spontaan hypertensieve rat (SHR) stam, omdat infarctgrootte is groter in SHRs blootgesteld aan focale cerebrale ischemie, vergeleken met normotensieve ratten 7-10. Beroerte inductie in SHRs is ook meer consistent en kan genereren minder sterfte dan in andere veelgebruikte stammen 11. Daarnaast moet fysiologische parameters worden gevolgd gedurende de operatie, omdat de fluctuaties kan toevoegen aan de variabiliteit in infarct volumes, deze parameters zijn onder meer de bloeddruk, arteriële O 2 en CO 2 verdiepingen, onderkoeling, en hyperglycemie, die kunnen ischemische letsel verergeren 2,12 . Hypothermie is van bijzonder belang, omdat het kan de mate van neuronale ischemische schade te verminderen, en dus, het plaatsen van de rat op een temperatuurregelingssystemen verwarmingselement tijdens de operatie is essentieel.
Wij maken gebruik van commercieel bereide silicium-coating hechtingen in deze procedure in een poging om de consistentie toename van de infarctgrootte 13-15. Traditioneel hebben intraluminale hechtingen gebruikt om de MCA af te sluiten is opgesteld door de vlam-afronding een 3-0 nylon hechting tip of met behulp van een hete lijmpistool om de vacht van de hechtdraad tip met een kleine kraal lijm 16. Deze procedures produceren hechtingen met verschillende diameters tip en dus kunnen meerdere pogingen tot occlusie nodig voor het vinden van een hechtdraad dat het schip diameter van een bepaalde rat wedstrijden. Extra variaties op de MCAO methode beschreven in deze video zijn onder meer distale occlusie, sparen de lenticulostriate vestigingen om een pure corticale infarct 17, en gelijktijdige occlusie van de MCA en ipsilaterale gemeenschappelijke halsslagader van onderpand bloedstroom 6,9 te verminderen.
De functionele effecten van een beroerte kan worden beoordeeld met behulp van een verscheidenheid aan gedrags-tests, waarin de tekorten in specifieke taken zijn opgenomen in een simpel scoren schaal. Bijvoorbeeld, Bederson et al.. 18 een neurologische score sortering ratten ontwikkeld op de omvang van de voorpoot flexie in een verhoogde lichaamshouding, asymmetrische weerstand tegen een zijdelingse duw, en open veld cirkelen gedrag. Ratten uitbreiding van beide voorpoten op de grond wanneer een verhoogde concentratie en vertonen geen andere tekorten werden gegradeerd "Normaal (0)", terwijl de ratten met contralaterale voorpoot flexie alleen werden geklasseerd met "matig tekorten (1)". "Ernstige graad 2" ratten weergegeven verminderde weerstand aan de contralaterale kant om een zijwaartse kracht en "ernstige graad 3" ratten bovendien bezig met cirkelen gedrag. Lagere kwaliteit afwijkend gedrag waren altijd waargenomen in de hogere rang (bv. graad 2 en 3 dieren ook getoond voorpoot flexie) en deze scores waren voorspellend voor de verschillen in infarctgrootte 18. Dus, zoals een eenvoudig puntensysteem zorgt voor een snelle, consistente semi-kwantitatieve beoordeling van de functionele tekorten van een beroerte.
Meting van de omvang van de cerebrale infarct wordt vaak bereikt door histologische kleuring voor beschadiging van het weefsel met behulp van TTC, cresyl violet (Nissl vlek) of hematoxyline en eosine. Magnetic resonance imaging technieken, waaronder diffusie-gewogen MRI van de infarct te visualiseren in de vroege tijdstippen na occlusie, voor de bepaling van een infarct volume in elke individuele rat mogelijk te maken zonder de noodzaak voor het oogsten van weefsel. Dit is vooral waardevol in studies gericht op het bepalen van de werkzaamheid van een neuroprotectieve behandeling na een beroerte; beeldvorming van de rat na MCAO, maar voorafgaand aan de behandeling administratie geeft de onderzoeker vertrouwen dat alle experimentele en controle dieren vergelijkbaar slagen ervaren om te beginnen, het verminderen van de verstorende effecten van de variabiliteit In een beroerte inductie.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicterende belangen te onthullen.
Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Wisconsin-Madison School of Medicine en Volksgezondheid en houdt zich aan de National Institutes of Health richtlijnen voor het gebruik van proefdieren.
Acknowledgments
Wij danken Beth Rauch en de Universiteit van Wisconsin beeldvorming van kleine proefdieren Faciliteit voor magnetische resonantie beeldvorming. Het ministerie van Neurologische Chirurgie aan de Universiteit van Wisconsin-Madison verstrekte financiering voor dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon suture | Doccol Corporation | 2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter | |
| Spontaneously hypertensive rats | Charles River Laboratories | 290-300 g, male | |
| Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads | Gaymar Industries | ||
| Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit | Summit Hill Laboratories | ||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | CellPoint Scientific | ||
| Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor | TSI Inc. |
References
- van Gijn, J., Dennis, M. S. Issues and answers in stroke care. Lancet. 352, Suppl 3. SIII23-27 (1998).
- Macrae, I. M. New models of focal cerebral ischaemia. British Journal of Clinical Pharmacology. 34, 302-302 (1992).
- Lee, R. M. Morphology of cerebral arteries. Pharmacol Ther. 66, 149-173 (1995).
- Sasaki, M., Honmou, O., Kocsis, J. D. A rat middle cerebral artery occlusion model and intravenous cellular delivery. Methods Mol Biol. 549, 187-195 (2009).
- Bråtane, B. T., Bastan, B., Fisher, M., Bouley, J., Henninger, N. Ischemic lesion volume determination on diffusion weighted images vs. apparent diffusion coefficient maps. Brain Res. 1279, 182-188 (2009).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Dogan, A., Başkaya, M. K., Rao, V. L., Rao, A. M., Dempsey, R. J. Intraluminal suture occlusion of the middle cerebral artery in Spontaneously Hypertensive rats. Neurol Res. 20, 265-270 (1998).
- Ogata, J., Fujishima, M., Morotomi, Y., Omae, T. Cerebral infarction following bilateral carotid artery ligation in normotensive and spontaneously hypertensive rats: a pathological study. Stroke. 7, 54-60 (1976).
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
- Duverger, D., MacKenzie, E. T. The quantification of cerebral infarction following focal ischemia in the rat: influence of strain, arterial pressure, blood glucose concentration, and age. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 449-461 (1988).
- Coyle, P. Different susceptibilities to cerebral infarction in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Sprague-Dawley rats. Stroke. 17, 520-525 (1986).
- Slivka, A. P. Hypertension and hyperglycemia in experimental stroke. Brain Res. 562, 66-70 (1991).
- Bouley, J., Fisher, M., Henninger, N. Comparison between coated vs. uncoated suture middle cerebral artery occlusion in the rat as assessed by perfusion/diffusion weighted imaging. Neurosci Lett. 412, 185-190 (2007).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156, 161-165 (2006).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical neurology. 24, 47-51 (1985).
- Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
