Summary
Chirurgische Induktion der ischämischen Hirnschädigung in der Ratte ist ein weit verbreitetes Modell für Schlaganfall-Forschung. Hier zeigen wir die Induktion fokaler zerebraler Ischämie durch Verschluss der mittleren Hirnarterie. Visualisierung der resultierenden Infarkt durch histologischer Färbung und Magnetresonanz-Tomographie wird ebenfalls angezeigt.
Abstract
Der Schlaganfall ist die häufigste Ursache für Behinderungen und die dritthäufigste Todesursache bei Erwachsenen weltweit 1. In der menschlichen Schlaganfall, gibt es eine sehr variable klinische Zustand; in der Entwicklung von Tiermodellen für fokale Ischämie, jedoch erreichen Reproduzierbarkeit der experimentell induzierten Infarktvolumen ist unerlässlich. Die Ratte ist ein weit verbreitetes Tiermodell für Schlaganfall aufgrund seiner relativ geringen Kosten der Tierhaltung und der Ähnlichkeit der Schädelbasis Auflage, dass der Mensch 2,3. Bei Menschen, der mittleren Hirnarterie (MCA) wird am häufigsten in der Schlaganfall-Syndrome und mehrere Methoden der MCA-Okklusion (MCAO) betroffen sind beschrieben worden, um dieses Krankheitsbild im Tiermodell nachzuahmen. Da Rekanalisation tritt häufig nach einem akuten Schlaganfall in den menschlichen, Reperfusion nach einem Zeitraum von Okklusion wurde in vielen dieser Modelle aufgenommen. In diesem Video zeigen wir die transiente endovaskuläre Naht MCAO Modell der spontan hypertensiven Ratte (SHR). Ein Filament mit einem Silizium-Spitze Beschichtung intraluminal an der MCA Ursprung für 60 Minuten gelegt, gefolgt von Reperfusion. Beachten Sie, dass die optimale Okklusion Zeitraum kann in anderen Rattenstämmen, wie Wistar oder Sprague-Dawley variieren. Mehrere Verhaltensindikatoren des Schlaganfalls in der Ratte gezeigt werden. Focal Ischämie bestätigt mit T2-gewichteten MRT-Bilder und durch Färbung Hirnschnitten mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) 24 Stunden nach MCAO.
Protocol
MCAO Rattenmodell
Präoperative Vorbereitungen
Aseptische Technik sollte für alle Überleben chirurgischen Eingriffen verwendet werden. Desinfizieren der chirurgischen Arbeit Oberfläche mit handelsüblichen Desinfektionsmitteln und bereiten sterilen OP-Packs von Instrumenten, Vorhänge, Gaze, Tupfer, Nahtmaterial und Skalpellklingen durch Autoklavieren. Ein OP-Maske, Haar Motorhaube und sterile Handschuhe getragen werden. Ein Germinator trockenen Kügelchen Sterilisator ist auch zur Herstellung von chirurgischen Instrumenten zwischen Verfahren resterilisiert wenn mehrere Ratte Operationen während einer Sitzung durchgeführt werden. Vorwärmen eine Wasser-ummantelten homeothermic Decke und unter eine saugfähige Unterlage, um Unterkühlung der Ratte während der Operation zu verhindern.
- Ort spontan hypertensiven Ratte (oder andere Rattenstamm der Wahl) in eine Induktion Kammer und induzieren Anästhesie mit 5% Isofluran (Anästhesiegerät sollte bis 1,0 L / min O 2 und 1,0 L / min N 2 O eingestellt werden). Lower um 1-2% Isofluran auf die Anästhesie aufrecht zu erhalten.
- Künstliche Tränen Salbe auf beiden Augen.
- Shave den Hals und links Halsbereich über die zukünftige Inzisionsstelle mit Klipper (Oster A5 mit # 10 Klinge).
- Bewerben Betadine eine Gaze und desinfizieren die Haut ab der Mitte des chirurgischen Bereich, spiralförmig nach außen. Spülen mit steriler Gaze mit 70% Ethanol, bewegen Pad in einem ähnlichen Muster. Wiederholen Sie die beiden Schritte für insgesamt drei Zyklen.
- Inject 0,2 ml 0,5% Bupivacain subkutan entlang der prospektiven Inzisionsstelle.
- Legen Sie Ratte in sterile glatt oder Abdeckung mit einem sterilen OP-Tuch.
Transient Verschluss der MCA
- Unter einem Operationsmikroskop wird ein ventralen Mittellinie Inzision durchgeführt und die oberflächliche Faszie präpariert.
- Unter der oberflächlichen Faszie, gibt es Drüsengewebe auf der linken Seite und drei Muskeln, die ein Dreieck bilden: die Mm, die Mittellinie über der Luftröhre liegt, die digastricus (leicht mit seinen strahlend weißen sehnigen Anteil identifiziert), und schließlich die Kopfnickers.
- Sorgfältige scharfe und stumpfe Präparation wird innerhalb des Dreiecks durchgeführt, um die Halsschlagader (exklusive stumpf kann durch einige vorgezogen werden, um ein versehentliches Gewebeschäden zu minimieren) zu identifizieren. Die externen, internen und Arteria carotis communis (ECA, ICA, CCA) ausgesetzt sind. Die Halsschlagader ist groß und sichtlich Impulse. Der Vagusnerv ist zu sehen Coursing entlang der lateralen Seite sowohl gemeinsame als auch A. carotis interna und ist stark von der gemeinsamen und A. carotis interna präpariert.
- Zwei ECA Zweige sind dann stark, seziert die erste Filiale Überschrift medial und der zweite Zweig Überschrift seitlich. Beide Zweige sind verödet und schneiden, das ermöglicht eine größere Leichtigkeit bei der Mobilisierung der größeren Schiffen.
- Die ECA ist nun seziert mehr rostral. Das Zungenbein können auftreten, und das wird das Ausmaß der rostralen Dissektion zu begrenzen. Die A. carotis externa wird als distal wie möglich mit 6-0 Seidenfaden gebunden.
- Eine weitere 6-0 Seidenfaden ist locker um die ECA in der Nähe der Bifurkation mit dem ICA platziert. Achten Sie darauf, das Schiff als intraluminale Faden für die Okklusion verwendet werden wird durchlaufen hier in einem späteren Schritt zu verschließen.
- Mikrochirurgische Clips sind auf gemeinsame und A. carotis interna in der Nähe der Bifurkation platziert.
- Eine erste partielle Arteriotomie ist zwischen den beiden Seidennaht Beziehungen zu den externen Halsschlagader erstellt.
- Einführung einer 2,2 -3,0 cm Länge von 4-0 monofilen Nylonfaden, mit einem Knick 2,0 cm von seinem abgerundeten, Silizium-beschichteten Spitze, in die ECA Lumen unten in Richtung der CCA, wo die mikrochirurgische Clip befindet. Diese Nähte sind kommerziell erhältlich (Doccol Corp, Redlands, CA, USA). Schneiden Sie den verbleibenden Teil der ECA (an der Stelle der partiellen Arteriotomie) auf den Stumpf und positionieren Sie den Stumpf unterhalb der Bifurkation der ECA und ICA frei, das wird leichter damit die intraluminale Faden in die ICA gleiten.
- Ziehen Sie die Seidenfaden um die ECA Stumpf auf die intraluminale Nylonnaht sichern und zu verhindern, Blutungen, und entfernen Sie dann die mikrovaskuläre Clip aus der ICA. Öffnen Sie den Clip vor der Herausnahme, bis die Blutung zu überprüfen.
- Weiter voran der Nylonfaden von der ECA zu ICA Lumen der A. cerebri media (MCA). Diese Länge ist in der Regel 18-20 mm und ist der Grund für die Platzierung ein Knick in der Naht vor dem Einsetzen. Nach einer variablen Länge von Nylonnaht eingelegt wird, kann Widerstand zu spüren sein. Wenn dies geschieht mit einem Großteil des Nylonnaht noch vorhanden außerhalb des Schiffes, bedeutet dies, dass die Naht ist wahrscheinlich in die pterygopalatina Arterie (siehe Hinweis unten). Ziehen Sie sich zurück und Kurve der Naht leicht entlang der ICA weiterhin, die mehr medial laufen. Darüber hinaus kann Dissektion der Ursprung der PPA getan werden, um besser zu visualisieren den Weg zuder intraluminale Filament. Fahren Sie mit dem Nylonfaden einzulegen, bis Widerstand bei und nach der 2 cm geknickt Position zu spüren ist. An diesem Punkt hat die intraluminale Naht die Herkunft der MCA blockiert. MCA-Okklusion kann durch die Überwachung der Reduzierung der regionalen zerebralen Blutflusses mittels Laser-Doppler-Flowmeter (siehe Materialien Tisch für eine Ausrüstung Quelle) bestätigt werden. Beachten Sie auch, dass der Ursprung des pterygopalatina Arterie aus der ICA direkt angebunden werden ausgeschaltet, wenn bevorzugt, um ein versehentliches Intubation dieses Schiffes mit dem intraluminalen Naht zu vermeiden.
- Starten Sie den Timer und aufzeichnen Okklusion Startzeit.
- Entfernen Sie die Mikroclip von der CCA.
- Schließen Sie den Schnitt (Dermis, Panniculus carnosus, subkutanen Gewebeschichten) schnell mit 3-0 Seidenfaden (eine einfache kontinuierliche Muster erleichtern Wiedereröffnung Reperfusion) und vorsichtig die Ratte in einem Käfig Erholung. Prüfen Sie, ob der Käfig Boden rund um Nase und Mund frei von Einstreu und Monitor aus der Narkose sind.
Restaurierung von MCA Durchblutung (Reperfusion)
- Kurz vor der Okklusion Zeit zu beenden, wieder betäuben die Ratte, desinfizieren die Inzisionsstelle mit Betadine und 70% Ethanol (3 Zyklen, wie bisher) und öffnen Sie den Schnitt durch das Entfernen der Schließung Nähten.
- Legen Sie eine Mikroclip auf der CCA, wie vorher.
- Ziehen Sie das Verschließen Naht leicht an der ICA, bis die Naht Ende ist sichtbar durch die ICA. Nicht vollständig entfernen Sie die Naht von der ICA / ECA!
- Legen Sie eine Mikroclip auf der ICA über das Ende des intraluminalen Naht.
- Vollständig zu entfernen okkludierende Naht und fest binden Sie die ECA Stumpf. Record-Ende der Okklusion (Reperfusion start) Zeit.
- Entfernen Sie die Mikroclip von der ICA.
- Entfernen Sie die Mikroclip von der CCA.
- Feuchten Sie die Region mit einigen Tropfen steriler Kochsalzlösung und schließen Sie den Einschnitt Schichten (Dermis, Panniculus carnosus, Unterhaut) mit 3-0 Seidenfaden mit einem einfachen Muster unterbrochen.
- Verwalten 0,05 mg / kg Buprenorphin (oder andere geeignete postoperative analgetische nach Ihrer institutionellen Richtlinien) in die Bauchhöhle Platz.
- Inject 5cc vorgewärmtem Kochsalzlösung intraperitoneal. Dies wird Flüssigkeitszufuhr während der Erholungsphase Bühne bieten.
- Monitor Erholung von Ratten aus der Narkose.
- Nachdem die Ratte hat sich erholt, für Verhaltenstherapie Hinweis auf Infarkt-Test, indem Sie die Ratte am Schwanz und beobachtet, ob die Ratte kann nach beiden Seiten drehen. Curling nur auf einer Seite zu erwarten ist. Einfache Bewertungsskalen können verwendet werden, um erste post-Infarkt behavorial funktionierenden Rekord (siehe Diskussion) werden.
- Weitere Injektionen von Buprenorphin (gleiche Dosierung wie oben) sollten alle 6 bis 8 Stunden für 24 Stunden zur Schmerzlinderung verabreicht werden. Extend Analgesie wenn Tier Anzeichen von Unwohlsein.
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Verschluss der mittleren Hirnarterie durch endovaskuläre Naht. Eine vereinfachte Darstellung der Schädelbasis Kreislaufsystem der Ratte wird mit einem Silizium-beschichteten intraluminale Naht das Verschließen der Ursprung des MCA gezeigt. Die OA und ST zweigt von der linken ECA wurden ligiert und eine Naht Krawatte um den ECA Stumpf hält die intraluminale Faden vorhanden. ACA, A. cerebri anterior, BA, basilaris, CCA, Arteria carotis communis; ECA, äußere Halsschlagader, ICA, A. carotis interna, MCA, mittleren Hirnarterie, OA, A. occipitalis, PCA, Arteria cerebri posterior; PComA, communicans posterior Arterie, PPA, pterygopalatina Arterie; ST, A. thyreoidea superior. Abbildung adaptiert von Sasaki et al. 4 und Lee 3.
Abbildung 2. Vertreter Kernspintomographie des koronalen Abschnitte Rattenhirn 24 Stunden nach 1 Stunde vorübergehend MCAO. Hirnödem begleitenden fokalen Ischämie wird visualisiert in T2-gewichteten MRT-Aufnahmen. Die Infarktzone erscheint hyperintens (hell) auf T2-Bilder. Ähnliche Infarkt Muster können mit fortgeschrittener MRI-Techniken wie Diffusions-gewichteten Bildgebung und scheinbaren Diffusionskoeffizienten Mapping 5 zu sehen.
Abbildung 3. Vertreter koronalen Abschnitte Rattenhirn mit TTC 24 Stunden nach 1 Stunde vorübergehend MCAO gefärbt. TTC Färbung zeigt weiß (ungefärbt) infarzierten Regionen der Großhirnrinde und Striatum in der gleichen Ratte wie in Abbildung 2 dargestellt. Beachten Sie, dass das allgemeine Muster der fokalen ischämischen Läsionen ähnlich wie in der MRT-T2-gewichteten Bildern zu sehen ist, obwohl die endgültige Infarktgebiet bestimmt histologisch kann etwas kleiner als der T2-Läsionen.
Discussion
Nagermodellen der zerebralen Ischämie kann als globale oder fokale und reversible oder irreversible klassifiziert werden. Wir verwenden eine reversible fokale Ischämie-Modell, um die Reperfusion, dass nach Rekanalisation in der menschlichen Schlaganfall-Patienten auftreten können imitieren. Während die Ratte Aktien den Vorteil, ähnlich kranialen Durchblutung der Mensch, der umfangreichen intrakranieller Kollateralkreislauf durch die Circle of Willis und leptomeningealen Anastomosen Ergebnisse in Widerspruch Infarkt Ausgaben 6. Wir nutzen die spontan hypertensiven Ratte (SHR) belastet, da die Infarktgröße ist größer in SHR ausgesetzt fokaler zerebraler Ischämie im Vergleich zu normotensiven Ratten 7-10. Stroke Induktion in SHR ist auch besser und kann weniger Todesfälle als in anderen häufig verwendeten Stämme 11 zu erzeugen. Darüber hinaus sollten physiologischen Parameter während der Operation überwacht werden, da Schwankungen der Variabilität in Infarktvolumen hinzufügen können; diesen Parametern gehören Bluthochdruck, arteriellen O 2 und CO 2-Gehalt, Hypothermie und Hyperglykämie, die zu einem Auftreten ischämischer Schädigung kann 2,12 . Unterkühlung ist ein besonderes Anliegen, weil sie den Grad der neuronalen ischämischen Verletzungen verringern können, und deshalb Platzierung der Ratte auf einem thermoregulatorische Heizkissen während der Operation ist von wesentlicher Bedeutung.
Wir beschäftigen kommerziell hergestellte Silizium-beschichtete Fäden in diesem Verfahren in einem Versuch, um die Konsistenz in der Infarktgröße 13-15 erhöhen. Traditionell haben die intraluminale Nähte verwendet werden, um die MCA verschließen durch Flamm-Runden einen 3:0 Nylonnaht Spitze oder mit einer Heißklebepistole zu beschichten die Naht Spitze mit einem kleinen Kleber Wulst 16 vorbereitet worden. Diese Verfahren erzeugen Fäden mit unterschiedlichen Spitzendurchmessern und somit können auch mehrere Versuche, Okklusion vor der Feststellung einer Naht, dass das Schiff Durchmesser von einem bestimmten Ratte passt zu verlangen. Weitere Varianten auf dem MCAO Methode in diesem Video beschrieben sind mehr Distalbiss, Schonung der lentikulostriatalen Filialen um eine reine Hirnareal 17 und gleichzeitigen Verschluss der MCA und ipsilateralen A. carotis communis Sicherheiten Durchblutung 6,9 zu reduzieren.
Die funktionellen Auswirkungen des Schlaganfalls kann anhand einer Vielzahl von Verhaltens-Tests, bei denen Defizite bei bestimmten Aufgaben in einem einfachen Scoring-Skala reflektiert werden. Zum Beispiel entwickelt Bederson et al. 18 a neurologischen Score Einstufung Ratten über das Ausmaß der forelimb Flexion in einer erhöhten Körperhaltung, asymmetrische Widerstand gegen eine seitliche push und offenes Feld kreisen Verhalten. Ratten die Verlängerung der beiden Vorderbeine auf den Boden, wenn erhöht und Aussteller keine andere Defizite wurden benotet "Normal (0)", während Ratten mit kontralateralen Vorderlauf Flexion nur wurden mit "Moderate Defizite (1)" eingestuft. "Schwere Klasse 2" Ratten angezeigt verringerte Widerstand auf der Gegenseite eine Querkraft und "Schwere Klasse 3" Ratten zusätzlich in kreisenden Verhaltensweisen beschäftigt. Unterstufe Verhaltensdefiziten waren immer in der nächsthöheren Besoldungsgruppe beobachtet (zB Stufe 2 und 3 Tiere ebenfalls angezeigt forelimb Flexion) und diese Werte wurden prädiktive Unterschiede in der Infarktgröße 18. So ermöglicht ein so einfaches Scoring-System für eine schnelle, konsistente semi-quantitative Beurteilung der funktionellen Defizite nach einem Schlaganfall.
Die Messung des Ausmaßes der Hirninfarkt wird üblicherweise durch histologische Färbung für Gewebeschäden mit TTC, Kresylviolett (Nissl-Färbung) oder Hämatoxylin und Eosin durchgeführt. Magnetic Resonance Imaging-Techniken, einschließlich Diffusions-gewichteten MRT zu dem Infarkt zu frühen Zeitpunkten sichtbar nach Okklusion, für die Bestimmung eines Infarktvolumen in jeder einzelnen Ratte ermöglichen, ohne die Notwendigkeit für die Ernte Gewebe. Dies ist besonders wertvoll in Studien zur Bestimmung der Wirksamkeit einer neuroprotektiven Behandlung nach einem Schlaganfall abzielt; Bildgebung der Ratte nach MCAO aber vor der Behandlung Verwaltung gibt der Prüfer das Vertrauen, dass alle Versuchs-und Kontrollgruppen Tieren ähnliche Striche erlebt zu starten, wodurch die Verwechslung Auswirkungen der Variabilität in der Schlaganfall-Induktion.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.
Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health und hält sich an die National Institutes of Health Richtlinien für die Verwendung von Versuchstieren verabschiedet.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Beth Rauch und der University of Wisconsin Small Animal Imaging Facility for Kernspintomographie. Die Abteilung für Neurochirurgie an der Universität von Wisconsin-Madison stellte Mittel für diese Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon suture | Doccol Corporation | 2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter | |
| Spontaneously hypertensive rats | Charles River Laboratories | 290-300 g, male | |
| Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads | Gaymar Industries | ||
| Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit | Summit Hill Laboratories | ||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | CellPoint Scientific | ||
| Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor | TSI Inc. |
References
- van Gijn, J., Dennis, M. S. Issues and answers in stroke care. Lancet. 352, Suppl 3. SIII23-27 (1998).
- Macrae, I. M. New models of focal cerebral ischaemia. British Journal of Clinical Pharmacology. 34, 302-302 (1992).
- Lee, R. M. Morphology of cerebral arteries. Pharmacol Ther. 66, 149-173 (1995).
- Sasaki, M., Honmou, O., Kocsis, J. D. A rat middle cerebral artery occlusion model and intravenous cellular delivery. Methods Mol Biol. 549, 187-195 (2009).
- Bråtane, B. T., Bastan, B., Fisher, M., Bouley, J., Henninger, N. Ischemic lesion volume determination on diffusion weighted images vs. apparent diffusion coefficient maps. Brain Res. 1279, 182-188 (2009).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Dogan, A., Başkaya, M. K., Rao, V. L., Rao, A. M., Dempsey, R. J. Intraluminal suture occlusion of the middle cerebral artery in Spontaneously Hypertensive rats. Neurol Res. 20, 265-270 (1998).
- Ogata, J., Fujishima, M., Morotomi, Y., Omae, T. Cerebral infarction following bilateral carotid artery ligation in normotensive and spontaneously hypertensive rats: a pathological study. Stroke. 7, 54-60 (1976).
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
- Duverger, D., MacKenzie, E. T. The quantification of cerebral infarction following focal ischemia in the rat: influence of strain, arterial pressure, blood glucose concentration, and age. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 449-461 (1988).
- Coyle, P. Different susceptibilities to cerebral infarction in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Sprague-Dawley rats. Stroke. 17, 520-525 (1986).
- Slivka, A. P. Hypertension and hyperglycemia in experimental stroke. Brain Res. 562, 66-70 (1991).
- Bouley, J., Fisher, M., Henninger, N. Comparison between coated vs. uncoated suture middle cerebral artery occlusion in the rat as assessed by perfusion/diffusion weighted imaging. Neurosci Lett. 412, 185-190 (2007).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156, 161-165 (2006).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical neurology. 24, 47-51 (1985).
- Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
