Summary
Induzione chirurgica del danno ischemico cerebrale nel ratto è un modello ampiamente utilizzato per la ricerca ictus. Qui mostriamo l'induzione di ischemia cerebrale focale da occlusione dell'arteria cerebrale media. Visualizzazione delle infarto risultante dalla colorazione istologica e la risonanza magnetica è anche mostrato.
Abstract
L'ictus è la principale causa di disabilità e la terza causa di morte negli adulti in tutto il mondo 1. In corsa umana, esiste una condizione clinica altamente variabile, per lo sviluppo di modelli animali di ischemia focale, tuttavia, raggiungere la riproducibilità del volume di infarto sperimentalmente indotto è essenziale. Il ratto è un modello animale ampiamente utilizzato per l'ictus a causa della sua relativamente bassi costi di animali di allevamento e alla somiglianza della sua circolazione cranica a quella degli esseri umani 2,3. Negli esseri umani, l'arteria cerebrale media (MCA) è più comunemente colpiti nelle sindromi ictus e diversi metodi di MCA occlusione (MCAO) sono state descritte per imitare questa sindrome clinica in modelli animali. Perché ricanalizzazione si verifica comunemente a seguito di un ictus acuto nell'uomo, riperfusione dopo un periodo di occlusione è stato incluso in molti di questi modelli. In questo video, dimostriamo il transitorio endovascolare modello sutura MCAO nel ratto spontaneamente iperteso (SHR). Un filamento con un rivestimento in silicone punta è posto intraluminally all'origine MCA per 60 minuti, seguita da riperfusione. Si noti che il periodo di occlusione ottimale può variare in altri ceppi di topo, come Wistar e Sprague-Dawley. Diversi indicatori comportamentali di ictus nei ratti sono mostrati. Ischemia focale la conferma con immagini T2 pesate risonanza magnetica e dalla colorazione sezioni cerebrali con 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) 24 ore dopo MCAO.
Protocol
MCAO Rat Modello
Preparativi prechirurgica
Una tecnica asettica deve essere utilizzato per tutte le procedure chirurgiche sopravvivenza. Disinfettare la superficie di lavoro con disinfettante chirurgico commerciali e preparare confezioni sterili di strumenti chirurgici, tendaggi, garze, tamponi, suture e lame di bisturi in autoclave. Una mascherina chirurgica, cofano capelli e guanti sterili devono essere indossati. Un Germinator secco tallone sterilizzatore è anche usato per sterilizzare gli strumenti chirurgici tra le procedure di se ambulatori topo più sarà fatto durante una sessione. Preriscaldare un acqua con camicia coperta homeothermic e posto sotto un tampone assorbente in modo da prevenire l'ipotermia del ratto durante l'intervento chirurgico.
- Luogo ratto spontaneamente iperteso (o ceppo ratto altro mezzo a scelta) in una camera di induzione e di indurre l'anestesia con il 5% isoflurano (macchina per anestesia deve essere impostato a 1,0 L / min O 2 e 1,0 L / min N 2 O). Inferiore al 1-2% isoflurano per mantenere l'anestesia.
- Applicare Artificial Tears unguento in entrambi gli occhi.
- Radersi la gola e regione del collo sinistro al di là del sito di incisione prospettico con tagliaunghie (Oster A5 con lama # 10).
- Applicare Betadine a una garza e disinfettare la pelle partendo dal centro della regione chirurgici, a spirale verso l'esterno. Risciacquare con garza sterile contenente etanolo al 70%, passando pad in un modello simile. Ripetere i due passaggi per un totale di tre cicli.
- Iniettare 0,2 ml di bupivacaina 0,5% per via sottocutanea lungo il sito di incisione futuri.
- Ratto posto in stockinette sterile o coprire con una garza sterile chirurgico.
Occlusione transitoria di MCA
- Sotto un microscopio operatorio, una incisione mediana ventrale viene eseguita e la fascia superficiale è sezionato.
- Sotto la fascia superficiale, non c'è tessuto ghiandolare ai muscoli a sinistra e tre che formano un triangolo: la sterno, che si trova sulla linea mediana della trachea, il digastrico (facilmente identificabile con le sue lucide parte bianca tendinee) e, infine, il muscolo sternocleidomastoideo.
- Attenta dissezione tagliente e smussa viene effettuata all'interno del triangolo di identificare l'arteria carotidea (esclusivo dissezione può essere preferito da alcuni per minimizzare i danni accidentali dei tessuti). Le arterie esterni, interni e carotide comune (ECA, ICA, CCA) sono esposti. L'arteria carotide è grande e visibilmente impulsi. Il nervo vago è visto che scorre lungo la superficie laterale di entrambe le arterie carotide comune e interna, ed è nettamente sezionato fuori dal comune e arterie della carotide interna.
- Due rami della Corte dei conti sono poi sezionati nettamente, il primo ramo voce medialmente e il secondo ramo voce lateralmente. Entrambi i rami sono cauterizzato e tagliate, che consente una maggiore facilità nel mobilitare le navi più grandi.
- L'ECA è ora sezionato più rostralmente. L'osso ioide si possono incontrare e questo limiterà l'estensione della dissezione rostrale. L'arteria carotide esterna è legato fuori come distalmente possibile con una sutura di seta 6-0.
- Un altro 6-0 sutura seta è posto liberamente intorno alla Corte dei conti nei pressi della biforcazione con la ICA. Fare attenzione a non occludere il vaso, come la sutura intraluminale da utilizzare per l'occlusione andranno di qui a un passaggio successivo.
- Clip microchirurgia sono posti sulle arterie carotide comune e interna vicino alla biforcazione.
- Un arteriotomia iniziale parziale si crea tra i due cravatte di seta di sutura sulla carotide esterna.
- Introdurre un 2,2 -3,0 cm di lunghezza di sutura 4-0 nylon monofilo, con un 2,0 cm kink dalla sua arrotondati, siliconato punta, nel lume della Corte dei conti verso il CCA in cui si trova la clip microchirurgico. Questi punti di sutura sono disponibili in commercio (Doccol Corp., Redlands, California, USA). Tagliate la parte restante della Corte dei conti (presso il sito del arteriotomia parziale) per liberare il tronco e la posizione del moncone di sotto della biforcazione della Corte dei conti e ICA, questo sarà più facilmente permettere la sutura intraluminale di scivolare nella ICA.
- Stringere la sutura di seta intorno al ceppo della Corte dei conti per assicurare la sutura intraluminale nylon e prevenire le emorragie, e quindi rimuovere la clip microvascolare dalla ICA. Aprire il clip prima di rimuoverla per controllare il sanguinamento.
- Continuare ad avanzare la sutura di nylon dalla Corte dei conti a lume di ICA l'arteria cerebrale media (MCA). Questa lunghezza è tipicamente 18-20 mm ed è la ragione per l'immissione una piegatura nella sutura prima dell'inserimento. Dopo un intervallo variabile della sutura in nylon è inserita, la resistenza può essere sentito. Se questo si verifica con gran parte della sutura in nylon ancora presenti al di fuori della nave, indica che la sutura è probabile che entrano l'arteria pterigopalatina (vedi nota sotto). Tirare indietro la sutura e la curva un po 'di proseguire lungo la ICA, che si svolgerà più medialmente. Inoltre, la dissezione delle origini della PPA può essere fatto per visualizzare meglio il percorsodel filamento intraluminale. Continuare a inserire la sutura in nylon fino ad avvertire resistenza durante e dopo la posizione di 2 centimetri piegato. A questo punto, la sutura intraluminale ha bloccato l'origine del MCA. MCA occlusione può essere confermato attraverso il monitoraggio della riduzione del flusso ematico cerebrale regionale mediante un misuratore laser Doppler (vedi tabella Materiali per una sorgente attrezzature). Si noti inoltre che l'origine dell'arteria pterigopalatina off della ICA può essere direttamente legato al largo, se si preferisce, al fine di evitare l'intubazione accidentale di questa nave con la sutura intraluminale.
- Avviare il timer e occlusione tempo di record di avvio.
- Rimuovere il microclip dal CCA.
- Chiudere l'incisione (derma, pannicolo carnosus, strati di tessuto sottocutaneo) rapidamente con 3-0 sutura seta (un semplice modello continuo faciliterà la riapertura di riperfusione) e con attenzione luogo il topo in una gabbia di recupero. Controllare che il pavimento della gabbia intorno al naso e la bocca sono privi di lettiera e di recupero monitor da anestesia.
Ripristino del flusso sanguigno MCA (riperfusione)
- Poco prima del periodo di occlusione dovrebbe terminare, ri-anestetizzare il topo, disinfettare il sito di incisione con Betadine e il 70% di etanolo (3 cicli, come prima) e riaprire l'incisione, eliminando i punti di sutura di chiusura.
- Posizionare un microclip sul CCA, come prima.
- Ritirare la sutura occlude parzialmente dalla ICA, fino alla fine sutura è visibile attraverso l'ICA. NON rimuovere completamente la sutura dalla ICA / Corte dei conti!
- Posizionare un microclip sul ICA sopra l'estremità della sutura intraluminale.
- Rimuovere completamente la sutura occlusione e strettamente legare il moncherino della Corte dei conti. Fine record di occlusione (inizio riperfusione) tempo.
- Rimuovere il microclip dalla ICA.
- Rimuovere il microclip dal CCA.
- Inumidire la regione con alcune gocce di soluzione fisiologica sterile e chiudere gli strati incisione (derma, pannicolo carnosus, tessuto sottocutaneo) con 3-0 sutura in seta con un semplice schema interrotto.
- Somministrare 0,05 mg / kg buprenorfina (o altro adeguato analgesico post-operatorio dopo le vostre linee guida istituzionali) nello spazio peritoneale.
- Preriscaldata iniettare 5 cc di soluzione fisiologica per via intraperitoneale. Ciò fornirà l'idratazione durante la fase di recupero.
- Monitorare il recupero di ratto dall'anestesia.
- Dopo il ratto ha recuperato, test per l'indicazione del comportamento di infarto tenendo il topo per la coda e osservando se il topo può girare su entrambi i lati. Leggendo solo da una parte ci si aspetta. Scale di punteggio semplice può essere usato per registrare iniziale post-infartuale funzionamento Behavorial (vedi Discussione).
- Ulteriori iniezioni di buprenorfina (dosaggio come sopra) dovrebbe essere data ogni 6 a 8 ore per 24 ore di sollievo dal dolore. Estendere l'analgesia se l'animale sta mostrando segni di disagio.
Rappresentante Risultati
Figura 1. Occlusione dell'arteria cerebrale media di sutura endovascolare. Uno schema semplificato del sistema circolatorio craniale del ratto è mostrato con un siliconato sutura intraluminale occludere l'origine della MCA. L'OA e rami ST off della Corte dei conti sinistra sono stati legati e un pareggio sutura intorno al ceppo della Corte dei conti tiene la sutura intraluminale in posizione. ACA, dell'arteria cerebrale anteriore, BA, arteria basilare; CCA, arteria carotide comune, della Corte dei conti, arteria carotide esterna, ICA, arteria carotide interna, MCA, arteria cerebrale media, OA, arteria occipitale; PCA, cerebrale posteriore; PComA, comunicante posteriore arteria, PPA, arteria pterigopalatina, ST, arteria tiroidea superiore. Figura adattata da Sasaki et al. 4 e Lee 3.
Figura 2. Rappresentante di imaging a risonanza magnetica di sezioni coronali di cervello di ratto 24 ore dopo 1 ora MCAO transitori. Edema cerebrale che accompagnano l'ischemia focale viene visualizzato nelle immagini MRI pesata in T2. La zona dell'infarto appare iperintensa (chiaro) sulle immagini T2. Modelli di infarto simile può essere visto con tecniche più avanzate come la risonanza magnetica per immagini pesata in diffusione e coefficiente di diffusione apparente mappatura 5.
Figura 3. Rappresentante sezioni coronali di cervello di ratto colorati con TTC 24 ore dopo 1 ora MCAO transitori. Colorazione TTC rivela bianco (senza macchia) infartuata regioni della corteccia cerebrale e striato nel ratto come quello mostrato nella Figura 2. Si noti che il modello generale di lesioni focali ischemiche è simile a quello visto nel MRI-T2 pesate, anche se l'area infartuale finale definito istologicamente può essere leggermente più piccola della lesione T2.
Discussion
Modelli di roditori di ischemia cerebrale possono essere classificati come globale o focale e come reversibili o irreversibili. Usiamo un modello di ischemia reversibile focale al fine di imitare il danno da riperfusione che possono verificarsi a seguito ricanalizzazione nei pazienti affetti da ictus. Mentre le quote ratto il vantaggio di simili circolazione cranica all'essere umano, la circolazione ampio collaterale intracranica a causa del circolo di Willis e leptomeningeo risultati anastomosi dei volumi infarto incoerente 6. Usiamo il ratto spontaneamente iperteso (SHR) ceppo perché dimensione dell'infarto è maggiore in SHRs esposti ad ischemia cerebrale focale rispetto ai ratti normotesi 7-10. Induzione corsa in SHRs è anche più consistente e può generare meno di mortalità rispetto ad altri ceppi comunemente usati 11. Inoltre, i parametri fisiologici devono essere monitorati per tutta la chirurgia, in quanto le fluttuazioni possono aggiungere alla variabilità dei volumi infarto; questi parametri includono la pressione sanguigna, arteriosa O 2 e CO 2 livelli, ipotermia, e iperglicemia, che può esacerbare danno ischemico 2,12 . L'ipotermia è particolarmente preoccupante perché può ridurre il grado di danno ischemico neuronale, e quindi, ponendo il ratto su una piastra elettrica di termoregolazione durante l'intervento è essenziale.
Ci avvaliamo di preparati commercialmente siliconato suture in questa procedura, nel tentativo di aumentare la coerenza nella dimensione infartuale 13-15. Tradizionalmente, le suture intraluminale utilizzato per occludere i MCA sono stati preparati da fiamma arrotondamento una punta di 3-0 sutura in nylon o utilizzando una pistola per colla a caldo cappotto la punta di sutura con una colla piccola biglia 16. Queste procedure di produrre punti di sutura con diametri variabili punta e, quindi, potrebbe richiedere diversi tentativi di occlusione prima di trovare una sutura che corrisponde al diametro del vaso di un topo dato. Ulteriori variazioni sul metodo MCAO descritto in questo video includono occlusione più distale, risparmiando i rami lenticulostriate in modo da avere un puro infarto corticale 17, e l'occlusione simultanea del MCA e ipsilaterale carotide comune per ridurre il flusso di sangue collaterali 6,9.
Gli effetti funzionali di ictus può essere valutato utilizzando una varietà di test comportamentali, in cui si riflettono i deficit in compiti specifici in una scala di punteggio semplice. Per esempio, Bederson et al. 18 ha sviluppato una classificazione neurologica ratti punteggio sul grado di flessione degli arti anteriori in una posizione corporea elevata, la resistenza asimmetrica per una spinta laterale e il comportamento in campo aperto cerchio. I ratti si estende sia arti anteriori al pavimento quando elevata e non presentano alcun deficit di altri sono stati classificati "Normale (0)", mentre i ratti con controlaterale flessione degli arti anteriori solo sono stati classificati con "deficit moderati (1)". "Gravi grado 2" ratti visualizzata la resistenza è diminuita dal lato controlaterale ad una forza laterale e "gravi di grado 3" ratti inoltre impegnati in cerchio comportamenti. Deficit comportamentali di grado inferiore sono sempre stati osservati nel grado superiore (ad esempio, di grado 2 e 3, gli animali anche visualizzato flessione degli arti anteriori) e questi punteggi sono risultati predittivi delle differenze nella dimensione infartuale 18. Così, ad esempio un sistema di punteggio semplice consente una rapida e coerente la valutazione semi-quantitativa del deficit funzionali da ictus.
Misurare l'entità di infarto cerebrale è comunemente realizzato dalla colorazione istologica di danno tissutale utilizzando TTC, violetto cresolo (Nissl macchia) o ematossilina ed eosina. Tecniche di imaging a risonanza magnetica, inclusa la diffusione RM pesata per visualizzare l'infarto in momenti subito dopo l'occlusione, consentono la determinazione di un volume di infarto in ogni singolo ratto, senza la necessità per la raccolta dei tessuti. Ciò è particolarmente prezioso in studi volti a determinare l'efficacia di un trattamento neuroprotettivo dopo ictus; immagini del ratto dopo MCAO ma la somministrazione trattamento prima dà la fiducia investigatore che tutti gli animali sperimentali e di controllo esperto colpi simili per iniziare, riducendo gli effetti confondenti di variabilità nell'induzione ictus.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso presso l'Università del Wisconsin-Madison School of Medicine e la sanità pubblica e si attiene alle linee guida dell'Istituto Nazionale di Sanità per l'uso di animali da esperimento.
Acknowledgments
Ringraziamo Beth Rauch e l'Università del Wisconsin Piccoli Fondo Imaging degli animali per la risonanza magnetica. Il Dipartimento di Neurochirurgia presso l'Università del Wisconsin-Madison ha finanziato questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon suture | Doccol Corporation | 2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter | |
| Spontaneously hypertensive rats | Charles River Laboratories | 290-300 g, male | |
| Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads | Gaymar Industries | ||
| Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit | Summit Hill Laboratories | ||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | CellPoint Scientific | ||
| Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor | TSI Inc. |
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