Summary
Démonstration dans cette vidéo sont les techniques pour flash de congélation et de sectionnement des tissus cérébraux embryonnaires à partir de la souris. Conseils utiles pour l'utilisation du cryostat sont donnés, y compris les méthodes de dépannage qui peut être utilisé pendant la coupe pour s'assurer que les sections résultante tissus sont exempts de fissures et d'autres distorsions.
Protocol
- Fixer le tissu dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant le temps désiré.
- Saccharose infuser tissus (cryoprotection)
- Faire solution de saccharose à 30% dans le PBS p / v en 2059 tube.
- Rincez le tissu 3x dans du PBS (~ 5 min avec bascule).
- Tissulaire lieu en solution de saccharose à 30%. Tissus ne va pas couler.
- Placez le tissu dans 4 ° C pendant la nuit, ou jusqu'à ce qu'il ait coulé.
- Taille de l'étiquette appropriée cryomold d'information et d'orientation.
- Remplissez cryomold avec OCT (éviter les bulles).
- Transfert des tissus à bain d'PTOM et l'enrober avec octobre
- Transfert des tissus aux PTOM cryomold.
- Orienter les tissus sous microscope.
- Verser l'azote liquide dans une boîte de Petri en plastique.
- Rapidement et soigneusement bas le tissu dans cryomold dans l'azote. (Ne pas immerger le haut de la cryomold.)
- Lorsque l'OCT est solide blanc, placez le tissu congelé en congélateur à -80 ° C pour le stockage.
- Equilibrer les tissus à ~ 20 ° C pendant au moins 30 min. avant la coupe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue-Tek Cryomold | Ted Pella, Inc. | 27181 | |
O.C.T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
Sucrose solution | 30% sucrose solution in PBS w/v | ||
paraformaldehyde | 4% paraformaldehyde in PBS |