Summary
一个
Abstract
独特品种
Protocol
1。小动物转基因利什曼原虫感染
1。寄生虫线
转基因利什曼原虫 SPP。寄生虫表达荧光素酶的生成使用episomal或作为一个整合载体。1 2克隆线是首选。两个要点是：
（一）综合超过episomal荧光素酶的荧光素酶是首选，因为这些寄生虫线，在理论上应该更好地保留在药物的压力，即没有引入到哺乳动物的基因。然而，即使整合的转基因可能会失去在低利率，3，因此它是至关重要的，保持对股市文化的选择性药物压力。在实践中， 利什曼原虫属。往往保留更长的时间内， 甚至在体内的episomal元素，虽然在每个细胞的质粒拷贝数的变化。两种类型的转基因寄生虫，他们应该总是通过在体外一次到动物接种前，以避免潜在的药物作用。
（二） 利什曼原虫 SPP。寄生虫可以减肥期间在体外培养的毒力。在某些物种（如属婴儿利什曼原虫，chagasi）这方面的损失可能会发生迅速的文化周。在其他物种（如属重大，L.墨西哥 ）的毒力保留长远来说，几个月到几年。尽管如此，克隆转染，应进行筛选，找出那些保留完整的小动物致害。许多实验室将连续传递寄生虫多次通过老鼠或仓鼠（4个或更多），以增加毒力前在实验中使用。
2。制备亚循环感染阶段寄生虫感染
利什曼原虫类感染形式。是由沙蝇传播到哺乳动物的主机是亚循环promastigote。因此，这种形式的寄生虫的动物感染的首选自然感染模型。虽然沙蝇都难以维持，在体外生长的寄生虫，将方便进行metacyclogenesis。文化在metacyclics％将随通行证，因为从动物，文化传媒和寄生虫的种类和应变隔离。
Metacyclics可以纯化由利什曼原虫的种类和线的积极或消极的选择。在终端的变化或侧链碳水化合物丰富的表面lipophosphoglycan石油气（LPG）L的残留主要让凝集损失5,6种其他利什曼原虫或 L纯化的外源凝集素PNA（花生凝集素）。缺乏亚循环液化石油气的主要突变体，可以净化一个聚蔗糖一步梯度7 IVIS可以使用大容量非纯化的文化，但应该认识到，这些含有亚循环的传染性形式的混合物。
通常情况下,15 - 20％的大宗固定相L.一chagasi文化恢复使用已经3个星期内的隔离仓鼠或鼠标的寄生虫metacyclics。寄生虫是通过离心洗涤，暂停缓冲液中所需的浓度（带或不带的Ca 2 +和Mg 2 +），并保持在4 °彗星长达2小时前接种到小鼠的HBSS或PBS。
3。 利什曼原虫属的接种途径的选择。到主机
人类利什曼病的临床疾病表现取决于种寄生虫和宿主因素。有相应的差异，在小鼠感染，导致调查，使用不同的模型和感染途径。例如，物种造成人类CL（如属重大，L. amazonensis）L.墨西哥，往往接种到小鼠皮下的脚垫或在耳后皮下。8,9种引起人类VL的往往是通过尾静脉注射推出10-12静脉或皮内注射在耳，13尾静脉感染已执行，也可以与仓鼠派生的无鞭毛体或promastigotes 。我们经常感染小鼠L. promastigote形式一chagasi，无论是皮内注射在耳后或跗外侧地区的14或静脉注射。
4。治疗前与麻醉小鼠
可用于野生型，转基因或基因敲除小鼠。虽然没有正式的，量化的，它似乎最有可能的，裸体或BALB / c小鼠，如白化允许通过组织黝黑的皮肤和头发的色素，如C57BL / 6小鼠相比，透光。
如注射氯胺酮加甲苯噻嗪的混合物[80-100毫克/公斤+ 10毫克/公斤，分别intrap anesthestic代理eritoneally（IP）]生理盐水稀释是一个首选的方法，因为动物会轻轻麻醉单剂量至少10分钟。 100 - 200ul总量腹腔注射使用25-30号针头。动物是手动坚决克制其腹部背侧皮肤和头部朝下。针头斜面向上，略有角度应定位。针尖应稍稍穿透腹壁左下象限。
一种吸入性麻醉剂，异氟醚等可交替使用，但动物只会留在麻醉状态下，只要吸入麻醉剂。
5。 利什曼原虫属鼠的感染。寄生虫
一旦动物轻轻麻醉，感染部位清洗干净，用70％乙醇或异丙醇。寄生虫的种类，剂量和感染途径是由研究者。皮（10μL）或肌肉注射（25-50μL）感染途径，以防止过多的组织损伤，应尽量减少注射量。允许在小鼠注射量可静脉（100-200微升），皮下（高达2毫升）或腹腔感染途径（高达2毫升）。
在我们的实验中所用的感染途径和卷包括皮在耳耳廓（10μL），在侧面皮下（100-200微升），腹腔内（100-200微升）或静脉（100-200μL）。寄生虫的剂量范围从10 2 10 7 promastigotes 。
2。 利什曼原虫生物发光成像使用的IVIS（ 活体成像系统）
1。制备D -荧光素在体内生物发光成像
D -荧光素（卡尺生命科学）是重组，以浓度15毫克/毫升贝科的PBS 镁带或不带+和Ca 2 +和注射器过滤（0.2微米）。等分被冻结在-80℃直到使用。注射前，荧光素被加热到37℃水浴中。
2。 D -荧光素注射
注射部位清洗和荧光素是由15毫克/毫升荧光素在DPBS溶液腹腔注射，剂量为150毫克/公斤，引入意识的动物。荧光素也可以被注入麻醉剂治疗的动物，但生物发光动力学可能会略有不同。
一旦注射到动物，荧光素迅速流传。它是非常有用的经验确定的最佳时间，收购后，每一个实验模型，并为不同的小鼠的解剖位置注射荧光素发光的数据，由于荧光素分布的动力学可能会有所不同。一个动力学曲线是由获得一个复制的图像序列。
3。动物轻轻麻醉
吸入或注射麻醉剂，可用于成像过程。异氟醚是简单的管理在这一阶段，因为大多数IVIS系统，有一个附加的麻醉室，麻醉鼻锥内成像室多方面的。麻醉是麻醉室和歧管内的成像室之间的分裂。
这些动物被放置在明确有机玻璃麻醉室轻轻2.5-3.5％异氟醚麻醉。动物视力监测，以确保有效的麻醉程度已引起的，和他们的呼吸不受阻碍地。核实撤出从痛苦的爪子压力缺乏足够程度的麻醉。后动物轻轻麻醉，异氟醚的数量可减少到1.5-2％。
4。发光法数据收集
充分麻醉动物从麻醉室转移到成像室和定位，使鼻子歧管锥将提供一个连续的异氟醚和调节流量。
生活图像软件程序（卡尺生命科学版）打开IVIS初始化。对于我们的实验中，我们利用精诺真IVIS 200的系统（卡尺生命科学）。 CCD摄像头将自动冷却，保持在适当的温度后，初始化的IVIS。摄像系统的设置和图像采集参数设置在IVIS系统控制面板。采集的参数主要是基于对动物的数量和生物发光的强度。重要的参数包括：成像模式（荧光或荧光），曝光时间（快门打开的时间），分级（决定在CCD上的像素大小），重点和主体高度（焦平面），F /停止（光圈大小）和领域的视角（FOV）。预设的视野s的IVIS成像系统200系列（方形的图像区域）4，6.5，13，20和25厘米（视场的宽度）。
按收购或收购的IVIS系统控制“窗口中的连续照片，发起的IVIS上的图像和数据采集。采集时间范围可以从几秒钟到几分钟。对于我们的实验中，我们使用60秒的默认曝光设置。
特写图像（小视野）可提供更高的分辨率，但不一定提高灵敏度相比，图像使用一个更大的视野。
后的成像过程中，动物是从成像室，回到笼子和监测，直到他们从麻醉中恢复过来。
7。数据分析
发光的数据分析使用的生活图像软件（精诺真）和对应的CCD相机检测到的光子数目表示光的强度。这些数据代表的伪彩色图像覆盖到动物的黑白照片。具体形象的地区，可通过创建感兴趣区域（ROI）分析。生活图像软件，并提供多种数据输出选项。分析数据的最简单的方法之一是选择一个利息率（ROI）的地区，并检测到的光子/秒的测量平均＃。然后这些数据可以被导出到一个试算表，如Microsoft Office Excel（微软公司）的。随后GraphPad棱镜（GraphPad软件）是用于生成这个手稿图。
3。代表性的成果
摘要：
IVIS技术使荧光素酶表达的利什曼原虫 SPP的可视化。生活在实时麻醉BALB / c小鼠的寄生虫。当底物荧光素的分布，通过组织，迅速氧化导致的D -荧光素的转基因寄生虫表达的荧光素酶的光发射。那些没有组织吸收光子检测动物的IVIS成像技术的CCD相机的表面。
1。造成人的内脏与人类皮肤利什曼病寄生虫的感染模型。
内脏利什曼病的小鼠模型，超过皮肤利什曼病模型的问题，因为感染的进度要求安乐死组小鼠在每次评估点。 IVIS的一个限制是光发射淬火有不同程度的影响，在不同的内脏组织，并与高血流量，如肝，脾组织可能超过皮肤问题。因此，IVIS可能无法检测的敏感的荧光素酶表达寄生在皮肤在肝脏和脾脏。另外还建议寄生虫的负载不应该组织的网站之间的比较。尽管如此，寄生虫的负载可以在同一组织之间一脉相承的年龄相匹配的感染小鼠进行比较。
荧光素酶的信号很容易在我们的实验中检测到内脏器官，促进动物之间感染的比较。一个5周的感染，引起人的内脏利什曼病寄生虫，李用荧光素酶表达的一个例子。 chagasi SSU/IR1SAT-LUC（一），如图1所示。 visceralized寄生虫感染5周后，可以检测小鼠1和2，在所有小鼠的肝脏和脾脏。图2显示了相同的寄生虫线，一个小时后引进的寄生虫的剂量滴定。例如，一个纵向感染与导致人类皮肤利什曼病，属的寄生虫墨西哥 SSU/IR1SAT-LUC（一），如图3所示。
2。动力学荧光素酶检测。
初步动力学研究是必不可少的，以最大限度地发射光子从发光寄生虫的检测。这一点很重要，以确定这一经验，作为最佳的成像时间可能会有所不同的寄生虫的数量和亮度分离，并在小鼠体内的发光微生物的解剖位置而定。动力学研究依赖的荧光素的分布在整个组织，窝藏荧光素酶表达利什曼原虫的小鼠组织，并在每个隔离寄生虫的荧光素酶的表达/酶活动的效率速度。被感染小鼠接种和荧光素如上所述，一个图像序列收集荧光素注射后，每2分钟。发出的光的幅度量化和图形来确定最大的检测点（见例如图1B）。一旦最大的光检测的时间是确定的，在实验中的所有图像利用荧光素接种后成像的同时，在图1A。我们的动力学研究与 L IV感染的小鼠肝脏证明峰值的荧光素酶信号一 IP chagasi 10至25分钟后，荧光素接种（图1B） 。
3。评估效率寄生虫接种。
IVIS可用于估计与荧光素酶表达的利什曼原虫 SPP的初次感染的一致性和效率。只要使用同样的路线是对每个动物，发出的光子可以被用来作为一个粗略的估计接种的疗效。一个例子是如图2所示，在BALB / c小鼠接种的亚循环L.表示数字一chagasi promastigotes，利什曼原虫一个visceralizing物种。一个小时后，感染小鼠接种与荧光素的IP，并采取了20分钟后图像。图中显示的黑白图像（图2A）和伪彩色发光（图2B）覆盖的图像。图2C显示选择的地区的利益，从鼠标图像（ROI），发射光子的数量。
在图2中的例子表明，感染剂量成正比，与越来越多的寄生虫发射光子的渐变。数据显示，类似到 L 主要和L 。 墨西哥 ，皮肤感染利什曼原虫属成像。非常敏感，允许少于10 4寄生虫明确可视。如这些数据可以用来量化感染强度。在图2b所示的例子中，有大约1光子/秒/寄生虫。
4。监测小鼠感染的过程。
皮肤利什曼病的小鼠模型的特征作为衡量纵向遵循感染病灶的大小。虽然病情恶化的一个很好的估计，病灶的大小是在组织中的寄生虫复制率炎症反应程度的影响。老鼠必须安乐死在实际测量寄生虫负荷实验结束。 IVIS可用于估计寄生虫负荷的进展， 纵向与利什曼原虫的物种，导致皮肤利什曼病感染小鼠的皮肤组织。图3表明，BALB / c小鼠接种0天皮下注射10 5 L.墨西哥表 达荧光素酶和成像对感染后的顺序几周内。图3A展品在感染后10-31周代表性的图像。相同的数据显示在定量的形式在图3B。重要的是，在感染部位的寄生虫的数量由IVIS可以量化，前病变是通过其他方法检测。
随着时间的推移，逐步增加在生物发光对应寄生虫数字的增长。信号强度，即光子/寄生虫/秒，可因寄生虫号码的功能，组织的位置，生长阶段和在体内的寄生虫健康。因此重要的是假设生物发光是成正比寄生虫数字的校准前寄生虫和发光之间的关系。在L 的情况下主要的 15 或 L 墨西哥 ，16出现在无鞭毛体生物发光衰减比较小，在脚垫病变相对promastigotes 。初步数据表明，衰减可能会更深刻属chagasi infantum 17或为L。 braziliensis 15。
图1。动力学的荧光素酶检测荧光素分布的动力学分析是建立在肝脏成像利什曼原虫感染的最佳时间。小鼠感染IV 10 7 L。一chagasi pIR1SAT - LUC（一）。 a）四个感染小鼠成像伴随着一个未受感染的小鼠，感染后5个星期。荧光素被注入了所有五个小鼠和图像IP收集24分钟，每两分钟。被选定的投资回报率和发光测定和量化（二）。
图2。评估寄生虫接种的效率 。成像和量化发光利什曼原虫寄生虫感染与IVIS 。在较低的右侧注入皮内，与野生型的BALB / c小鼠的HBSS（模拟） 或转基因利什曼原虫一chagasi L。一chagasi pIR1SAT - LUC（一）。 IVIS成像技术接种后的一个小时，小鼠，然后进行分析。 A）的小鼠的黑白照片立即采取前荧光信号（光强）测定。红色箭头指向每个注射部位动物。 B）发光的伪彩色图像叠加在照片上。三）被选定的感兴趣区域（ROI）（红色圆圈）和发光在每个ROI量化。这些数据代表感染的投资回报率减去的投资回报率的模拟感染的净发光。
图3。长期与造成人类皮肤利什曼病寄生虫感染寄生在一个单一的动物注射发光利什曼原虫墨西哥pIR1SAT - LUC（一）负担的时间课程评价。野生型BALB / c小鼠注射皮下100,000固定相的转基因利什曼原虫墨西哥pIR1SAT - LUC（一）在飞节。 IVIS收集资料，从感染小鼠在感染后表示数周。一）发光的伪彩色图像叠加到相应时间点的黑白照片。二）净投资回报率是通过测量发光在受感染的跗关节和减去背景的投资回报率，从对侧未受感染的典当绘制决定。散点图代表在不同的时间点感染后的净投资回报率。
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Discussion
在活体成像系统（IVIS），为整个动物的成像或体内成像实验感染利什曼病的不同形式的模型的 方法。18,16利什曼原虫SPP。寄生虫，可设计，以表达萤火虫荧光素酶在体内 IVIS成像技术检测的水平。这种方法的主要优势之一是它允许利什曼原虫属非侵入性可视化。活的动物宿主内。该方法已应用于其他传染性疾病模型，传染性病原体可以表达的转基因。19 20此外，IVIS已经作为一个模型用来评估药物治疗利什曼原虫主要感染的C57BL / 6小鼠的皮肤。 16,21
有一些重要的注意事项，这种方法的局限性。哺乳动物的主机内的寄生虫的位置，在寄生虫病的荧光素酶的表达强度的共同因素的情况下，CCD相机检测到的光信号的强度可能会受到的D -荧光素的氧化反应覆组织的光吸收。此外，在肝脏和脾脏的信号强度弱于在皮肤上的信号，可能是由于局部的血液供应和覆组织淬火的光子每秒每寄生虫水平。 ，随着时间的推移，或在同一组织之间的动物在一个单一的动物发出的光子的量化可以用来比较逐步感染16，直到进一步优化但是，这些警告将限制的灵敏度和实用的方法定量评估与visceralizing 利什曼原虫 SPP深部感染。最后，图像有可能较弱（如C57BL / 6）在黑色比白色的小鼠（如BALB / C）小鼠。剃须发过的皮肤覆盖感兴趣的领域，可以帮助黑鼠的信号检测。
其他注意事项是需要验证的寄生虫负荷的定量测量的IVIS。显微镜，定量PCR和IVIS之间的比较已经在少数情况下，但将作为衡量疾病进展的每一个系统，以验证使用该方法需要22 16成像的新方法不断涌现，这可能是耦合生物发光的图像。16除了转基因寄生虫，宿主动物，可设计，以表达发光或荧光分子。使用这项技术的未来研究，包括动物在特定的细胞车厢中表达外源基因检测的发病机制和寄生虫的同时涉及的宿主因素。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是从退伍军人事务部的优异审查授予部分经费，由美国国立卫生研究院拨款AI045540，AI067874，AI076233 - 01和AI080801（水电部），和AI29646（SMB）。这项工作是在CT和JG的经费由美国国立卫生研究院的T32 AI07511部分。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin Potassium Salt | Reagent |  Caliper Life Sciences |
122796 | |
| IVIS Imaging System 200 Series | Equipment | Caliper Life Sciences |
Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum. |
References
- Capul, A. A., Barron, T., Dobson, D. E., Turco, S. J., Beverley, S. M. Two functionally divergent UDP-Gal nucleotide sugar transporters participate in phosphoglycan synthesis in Leishmania major. J Biol Chem. 282, 14006-14017 (2007).
- LeBowitz, J. H., Coburn, C. M., McMahon-Pratt, D., Beverley, S. M. Development of a stable Leishmania expression vector and application to the study of parasite surface antigen genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9736-9740 (1990).
- Mureev, S., Kushnir, S., Kolesnikov, A. A., Breitling, R., Alexandrov, K. Construction and analysis of Leishmania tarentolae transgenic strains free of selection markers. Mol Biochem Parasitol. 155, 71-83 (2007).
- Chakkalath, H. R. Priming of a beta-galactosidase (beta-GAL)-specific type 1 response in BALB/c mice infected with beta-GAL-transfected Leishmania major. Infect Immun. 68, 809-814 (2000).
- Sacks, D. L., Perkins, P. V. Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes. Science. 223, 1417-1419 (1984).
- da Silva, R., Sacks, D. L. Metacyclogenesis is a major determinant of Leishmania promastigote virulence and attenuation. Infect Immun. 55, 2802-2806 (1987).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99, 97-103 (2001).
- Scott, P., Caspar, P., Sher, A. Protection against Leishmania major in BALB/c mice by adoptive transfer of a T cell clone recognizing a low molecular weight antigen released by promastigotes. J Immunol. 144, 1075-1079 (1990).
- Belkaid, Y. The role of interleukin (IL)-10 in the persistence of Leishmania major in the skin after healing and the therapeutic potential of anti-IL-10 receptor antibody for sterile cure. J Exp Med. 194, 1497-1506 (2001).
- Wilson, M. E. Local suppression of IFN-gamma in hepatic granulomas correlates with tissue-specific replication of Leishmania chagasi. J Immunol. 156, 2231-2239 (1996).
- McElrath, M. J., Murray, H. W., Cohn, Z. A. The dynamics of granuloma formation in experimental visceral leishmaniasis. J Exp Med. 167, 1927-1937 (1988).
- Ato, M. Loss of dendritic cell migration and impaired resistance to Leishmania donovani infection in mice deficient in CCL19 and CCL21. J Immunol. 176, 5486-5493 (2006).
- Ahmed, S. Intradermal infection model for pathogenesis and vaccine studies of murine visceral leishmaniasis. Infect Immun. 71, 401-410 (2003).
- Kamala, T. Hock immunization: a humane alternative to mouse footpad injections. J Immunol Methods. 328, 204-214 (2007).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cell Microbiol. 7, 383-392 (2005).
- Brittingham, A., Miller, M. A., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Regulation of GP63 mRNA stability in promastigotes of virulent and attenuated Leishmania chagasi. Mol Biochem Parasitol. 112, 51-59 (2001).
- Roy, G. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Mol Biochem Parasitol. 110, 195-206 (2000).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Hardy, J., Margolis, J. J., Contag, C. H. Induced Biliary Excretion of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 74, 1819-1827 (2006).
- Lecoeur, H. Optimization of Topical Therapy for Leishmania major Localized Cutaneous Leishmaniasis Using a Reliable C57BL/6 Model. PLoS Negl Trop Dis. 1, e34-e34 (2007).
- Lang, T., Lecoeur, H., Prina, E. Imaging Leishmania development in their host cells. Trends Parasitol. 25, 464-473 (2009).
