Summary
و
Abstract
أنواع متميزة
Protocol
1. العدوى من الحيوانات الصغيرة مع الليشمانية المعدلة وراثيا
1. خطوط الطفيلي
الليشمانية المعدلة وراثيا النيابة. ويفضل التعبير عن الطفيليات يتم إنشاؤها باستخدام luciferase episomal أو ناقلات دمج حسبما 1 2 خطوط نسيلي. نقطتين هامتين هما :
(أ) هو المفضل luciferase المتكاملة عبر luciferase episomal ، لأن هذه الخطوط من الناحية النظرية يجب أن يحتفظ الطفيلي أفضل التحوير في غياب أي المخدرات ، والضغط بعد الأخذ في الثدييات. ويمكن أن تضيع الجينات المحورة ولكن متكاملة حتى بأسعار منخفضة ، 3 لذا فمن الأهمية بمكان للحفاظ على ضغط انتقائي على ثقافة المخدرات الأسهم. في الممارسة العملية ، الليشمانية النيابة. غالبا ما تحتفظ العناصر episomal لفترات زمنية ممتدة حتى في الجسم الحي ، على الرغم من التباين في عدد نسخ البلازميد لكل خلية. 4 للحصول على أي نوع من الطفيليات المعدلة وراثيا ، وينبغي دائما أن تكون مرت في وقت واحد قبل المختبر للتلقيح الحيوانات في المخدرات لتجنب الآثار المحتملة.
(ب) SPP الليشمانيا. يمكن أن تفقد الطفيليات الفوعة في المختبر خلال الثقافة. في بعض الأنواع (مثل الدونوفانية L. ، L. الطفلية الشاغاسية) يمكن أن تحدث هذه الخسارة سريعا خلال أسابيع من الثقافة. في الأنواع الأخرى (على سبيل المثال ، L. الكبرى ، L. المكسيكية) يتم الاحتفاظ الفوعة على المدى الطويل ، لأشهر وسنوات. ومع ذلك ، ينبغي فحص transfectants نسيلي لتحديد تلك الفوعة الاحتفاظ الكامل للحيوانات الصغيرة. سوف تمر العديد من مختبرات الطفيليات متسلسل عدة مرات (4 أو أكثر) من خلال الفئران أو الهامستر لزيادة الفوعة قبل استخدامها في التجارب.
2. إعداد الطفيليات المعدية المرحلة metacyclic للعدوى
شكل عدوى من SPP الليشمانيا. التي تنتقل عن طريق ذبابة الرمل إلى المضيف الثدييات هو المشيقة metacyclic 5 لذلك ، ويفضل الإصابات الحيوانية مع هذا الشكل من طفيل نموذجا للعدوى الطبيعية. على الرغم من ذباب الرمل صعبة للحفاظ على ، والطفيليات نمت في المختبر الخضوع metacyclogenesis مريح. سيتم في المئة من metacyclics موجودة في ثقافة تختلف مع عدد يمر منذ بمعزل عن الحيوان ، ووسائل الإعلام والثقافة ، ونوع الطفيل والسلالة.
يمكن تنقية Metacyclics عن طريق الانتقاء إيجابية أو سلبية تبعا للأنواع وخط الليشمانيا. تغييرات في المحطة أو مخلفات الكربوهيدرات جانب سلسلة من lipophosphoglycan السطحية وفيرة (LPG) من L. الرئيسية تسمح تطهيرها من فقدان تراص مع السلطة الوطنية الفلسطينية lectin (راصة الفول السوداني). 5،6 الأنواع الأخرى أو الليشمانية L. يمكن تنقية المسوخ الكبرى تفتقر metacyclic غاز البترول المسال على التدرج خطوة Ficoll. لا يمكن أن يؤديها 7 IVIS به معظم المنظمات غير المنقى الثقافات ، ولكن ينبغي الاعتراف بأن هذه تحتوي على خليط من أشكال أقل metacyclic والمعدية.
عادة ، 15-20 ٪ من المرحلة القرطاسية بالجملة L. ط يتم استرداد الثقافات الشاغاسية كما metacyclics باستخدام الطفيليات التي تم عزلها في غضون 3 أسابيع من الهمستر أو الماوس. تغسل الطفيليات بواسطة الطرد المركزي ، علقت لتركيز المطلوب في المخزن (PBS HBSS أو مع أو بدون كا 2 + 2 + والمغنيسيوم) درجة مئوية ، وحافظ على 4 لتصل إلى 2 ساعة قبل التلقيح في الماوس.
3. اختيار الطريق لتلقيح SPP الليشمانيا. في استضافة
المظاهر السريرية للداء الليشمانيا الإنسان تختلف تبعا لنوع كل من الطفيل والعوامل المضيفة. هناك اختلافات في المقابلة عدوى الفئران ، مما أدى إلى المحققين استخدام نماذج مختلفة وطرق العدوى. على سبيل المثال ، غالبا ما يتم تلقيح الأنواع تسبب CL الإنسان (مثل L. الكبرى ، L. المكسيكية ، L. الأمازونية) في الفئران تحت الجلد في قاطع الطريق أو intradermally في الأذن. وكثيرا ما تقدم 8،9 الأنواع تسبب VL الإنسان عن طريق الوريد من خلال الذيل 10-12 الوريد أو intradermally في الأذن ، وقد تم تنفيذ 13 التهابات الوريد الذيل إما مع الهامستر المستمدة amastigotes أو مع promastigotes. نحن يصيب الفئران عادة مع النموذج المشيقة من L. ط الشاغاسية ، إما intradermally في الأذن أو المنطقة الرصغي الوحشي 14 أو عن طريق الوريد.
4. المعالجة المسبقة من الفئران مع مخدر
ويمكن استخدام الفئران خروج المغلوب من النوع البري ، المعدلة وراثيا أو الجينات. وإن لم يكن رسميا ، كميا ، على ما يبدو على الأرجح أن عارية أو البيضاء مثل BALB / ج الفئران تسمح لنقل مزيد من الضوء من خلال أنسجة الفئران مقارنة مع البشرة الداكنة وصبغة الشعر مثل C57BL / 6.
anesthestic كلاء مثل حقن مزيج من الكيتامين زائد زيلازين [80-100 ملغم / كغم + 10 ملغم / كغم ، على التوالي ، intraperitoneally (IP)] مخففة في المياه المالحة هي واحدة الأسلوب المفضل ، لأن هذه الحيوانات سيتم تخدير طفيفة لا يقل عن 10 دقيقة مع جرعة واحدة. يتم حقن 100 200ul إجمالي حجم IP باستخدام إبرة قياس 25-30. هي مقيدة يدويا الحيوانات بحزم بشرتهم الظهرية مع البطن إلى أعلى ورأسه إلى أسفل وأوضح. وينبغي وضع الإبرة حتى مع شطبة والزاوية قليلا. يجب أن رأس الإبرة مجرد اختراق أقل قليلا من ربع الدائرة الأيسر من جدار البطن.
يمكن بالتناوب نشوق مخدر مثل isoflurane استخدامها ، ولكن الحيوانات سيبقى تحت التخدير فقط طالما أنهم استنشاق عامل مخدر.
5. إصابة الفئران مع SPP الليشمانيا. طفيليات
بمجرد أن يتم تخدير الحيوانات باستخفاف ، يتم تنظيف هذه المواقع العدوى بنسبة 70 ٪ أو الآيزوبروبيل الكحول الإيثيلي. يتم تحديد مسار الأنواع ، وجرعة والعدوى الطفيلية من قبل المحقق. وينبغي التقليل من حجم حقن لمنع تلف الأنسجة المفرط للالأدمة (10 ميكرولتر) أو العضلي (25-50 ميكرولتر) طرق العدوى. ويمكن حقن كميات المسموح بها في الفئران عن طريق الوريد ليكون أكبر (100-200 ميكرولتر) ، تحت الجلد (لتصل إلى 2 مل) أو داخل الصفاق (تصل إلى 2 مل) من طرق العدوى.
طرق العدوى وحدات التخزين المستخدمة في تجاربنا تشمل الأدمة في الصيوان الأذن (10 ميكرولتر) ، تحت الجلد في الجناح (100-200 ميكرولتر) ، داخل الصفاق (100-200 ميكرولتر) أو عن طريق الوريد (100-200 ميكرولتر). وتراوحت الجرعات الطفيلي من 2 إلى 10 promastigotes 7 10.
2. Bioluminescent تصوير الليشمانية باستخدام IVIS (نظام التصوير في فيفو)
1. إعداد D - luciferin لفي التصوير bioluminescent فيفو
هو إعادة مد Luciferin (الفرجار LifeSciences) إلى تركيز 15 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني Dulbecco مع أو بدون المغنيسيوم والكالسيوم 2 + 2 + ، والمحاقن تصفيتها (0.2 ميكرون). وتجمد Aliquots في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. قبل الحقن ، وتحسنت luciferin إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
2. حقن D - luciferin
يتم تنظيف موقع الحقن ، وقدم luciferin في الحيوانات واعية من قبل حقن داخل الصفاق من حل luciferin 15 ملغ / مل في DPBS ، بجرعة 150 ملغم / كغم. ويمكن أيضا أن تكون Luciferin حقن مخدر معاملة الحيوانات ، ولكن حركية تلألؤ بيولوجي قد يختلف قليلا.
حقنه مرة واحدة في الحيوانات ، luciferin يدور بسرعة. ومن المفيد تجريبيا لتحديد الوقت الأمثل لاكتساب البيانات الانارة بعد الحقن luciferin لكل والنموذج التجريبي للمواقع تشريحية مختلفة من الفئران ، وذلك لأن حركية توزيع luciferin قد تختلف. يتم إنشاء منحنى الحركية من خلال الحصول على سلسلة من الصور تكرار.
3. تخدير الحيوانات باستخفاف
يمكن أن تستخدم عن طريق الحقن أو الاستنشاق التخدير لإجراء التصوير. Isoflurane أبسط لإدارة في هذه المرحلة ، لأن معظم الأنظمة IVIS لها غرفة التخدير المرفقة ومشعب مخروط الأنف التخدير داخل غرفة التصوير. يتم تقسيم التخدير بين غرفة التخدير والمتعددة داخل غرفة التصوير.
وتوضع الحيوانات في غرفة التخدير واضحة وزجاج شبكي تخدير باستخفاف مع 2،5-3،5 ٪ isoflurane. ويتم رصد لضمان بصريا الحيوانات قد يسببها درجة فعالية التخدير ، وأنه تنفسهم ودون عوائق. يتم التحقق من درجة كافية من التخدير بسبب عدم الانسحاب من الضغط مخلب مؤلمة. وربما يتم تخفيض مبلغ isoflurane إلى 1،5-2 ٪ بعد تخدير الحيوانات باستخفاف.
4. يتم جمع البيانات Bioluminescent
يتم نقل الحيوانات تخدير كاف من غرفة إلى غرفة التخدير والتصوير وضعه بحيث المخاريط الأنف تعلق على مشعب سيلقي التدفق المستمر والمنظم للisoflurane.
يتم فتح البرنامج صورة البرنامج المعيش (الفرجار علوم الحياة) وتتم تهيئة IVIS. لتجاربنا ، ونحن نستخدم 200 Xenogen IVIS النظام (الفرجار علوم الحياة). وسيتم الكاميرا CCD تبرد تلقائيا والحفاظ على درجة حرارة مناسبة بعد تهيئة IVIS. يتم تعيين إعداد نظام الكاميرا والمعلمات الحصول على الصور في لوحة التحكم IVIS النظام. وتستند إلى حد كبير على المعلمات اقتناء عدد من الحيوانات وشدة تلألؤ بيولوجي. المعالم الهامة تشمل ما يلي : وضع التصوير (الانارة أو فلوري) ، ووقت التعرض (الوقت الذي يتم فتح مصراع) ، binning (تحديد حجم بكسل على اتفاقية مكافحة التصحر) ، والتركيز والارتفاع الموضوع (البؤري) ، و / إيقاف (حجم الفتحة) ومجال الرؤية (FOV). مسبقا FOVق (المناطق صورة مربعة) لسلسلة 200 IVIS التصوير النظام هي 4 ، 6.5 ، 13 ، 20 و 25 سم (عرض FOV).
الضغط على اكتساب أو حيازة الصور المستمر في إطار نظام التحكم IVIS يبدأ الصور والحصول على البيانات على IVIS. ويمكن اقتناء مجموعة مرات من بضع ثوان إلى عدة دقائق. لتجاربنا ، ونحن نستخدم ال 60 تعرض ثان يتضمن الافتراضي.
ربما صورة عن قرب (FOV الصغيرة) توفير قدر أكبر من القرار ، ولكن ليس بالضرورة زيادة في الحساسية بالمقارنة مع صورة التي يتم التقاطها باستخدام أكبر FOV.
بعد إجراء التصوير ، وتتم إزالة الحيوانات من غرفة التصوير ، وعاد إلى أقفاصها ومراقبتها حتى يشفى من التخدير.
7. تحليل البيانات
ويتم تحليل البيانات باستخدام برنامج التلألؤ صورة المعيش (Xenogen) ويتوافق مع شدة الضوء وأعرب عدد من الفوتونات الكشف عنها بواسطة كاميرا CCD. وتمثل هذه البيانات عن طريق صورة شبه لون غير مضافين إلى صورة فوتوغرافية بالأبيض والأسود لهذه الحيوانات. ويمكن تحليل مناطق معينة من الصورة من خلال خلق مناطق الفائدة (ROI). البرنامج صورة حية لا توفر مجموعة متنوعة من الخيارات إخراج البيانات. واحدة من أبسط الطرق لتحليل البيانات لتحديد منطقة ذات الاهتمام (ROI) ، وقياس متوسط عدد الفوتونات / الثانية التي يتم الكشف عنها. ويمكن بعد هذه البيانات يتم تصديرها إلى ورقة انتشار مثل Microsoft Office اكسل (مايكروسوفت). واستخدمت في وقت لاحق GraphPad بريزم (GraphPad البرامج) لإنشاء الرسوم البيانية لهذه المخطوطة.
3. ممثل النتائج
ملخص :
IVIS التكنولوجيا يمكن تصور luciferase ، معربا عن SPP الليشمانيا. طفيليات تعيش في تخدير BALB / ج الفئران في الوقت الحقيقي. بمجرد أن يوزع من خلال الركيزة luciferin الأنسجة ، وأكسدة السريع مد luciferin luciferase التي أعرب عنها الطفيليات وراثيا يسبب ضوء بانبعاثها. يتم الكشف عن الفوتونات التي لم يتم استيعابها من قبل الأنسجة على سطح الحيوان بواسطة كاميرا CCD من تكنولوجيا التصوير IVIS.
1. نماذج من الإصابة بالطفيليات تسبب داء الليشمانيات الجلدي البشري مقابل الحشوية البشرية.
نماذج الفئران من داء الليشمانيات الحشوي هي أكثر تعقيدا من النماذج من الليشمانيا الجلدية ، لأن التقدم للعدوى يتطلب القتل الرحيم مجموعات من الفئران في كل نقطة زمنية المقررة. وجود قيود على IVIS هو أن تطفئ الضوء انبعاثات بدرجات مختلفة في مختلف الأنسجة الحشوية ، والأنسجة مع تدفق الدم المرتفع مثل الكبد والطحال قد تكون أكثر تعقيدا من الجلد. لذلك ، قد لا يكون IVIS حساسة مثل للكشف عن luciferase ، معربا عن الطفيليات في الكبد والطحال كما هو الحال في الجلد. وينصح أيضا أنه لا ينبغي أن يحمل الطفيل يمكن مقارنة بين المواقع الأنسجة. ومع ذلك ، يمكن مقارنة الأحمال الطفيلية في أنسجة نفس العمر المتطابقة بين الفئران المصابة من نفس السلالة.
تم الكشف بسهولة إشارة luciferase في الأجهزة الحشوية في تجاربنا ، وتسهيل المقارنة بين العدوى بين الحيوانات. مثال للعدوى خلال 5 أسابيع مع الطفيلي ، معربا عن luciferase يسبب داء الليشمانيات الحشوي البشري ، لى. ويرد الشاغاسية SSU/IR1SAT-LUC (A) ، في الشكل 1. بعد 5 أسابيع من العدوى ، ويمكن الكشف عن الطفيليات visceralized في أكباد الفئران وجميع في الطحال الفئران 1 و 2. الشكل 2 يبين معايرة الجرعة مع خط الطفيلي نفسه ، بعد ساعة واحدة مقدمة من الطفيلي. مثال على الإصابة بالطفيليات طولية تسبب داء الليشمانيات الجلدي البشري ، L. ويرد المكسيكية SSU/IR1SAT-LUC (A) ، في الشكل 3.
2. حركية الكشف luciferase.
دراسات الحركية الأولية ضرورية لتحقيق أقصى قدر من كشف الفوتونات المنبعثة من الطفيليات bioluminescent. من المهم تحديد هذا تجريبيا ، حيث أن الوقت الأمثل التصوير سوف تختلف من المرجح اعتمادا على عدد وسطوع الطفيلي عزل وعلى موقع التشريحية من الكائنات الدقيقة الانارة في الفئران. الدراسات الحركية تعتمد على معدل التوزيع في جميع أنحاء luciferin الأنسجة ، والأنسجة الماوس بايواء luciferase ، معربا عن الليشمانيا ، وكفاءة النشاط التعبير / انزيم luciferase في كل الطفيلي عزل. عدد المصابين بهذا المرض وتحصين الفئران مع luciferin على النحو الموصوف أعلاه ، ويتم جمع سلسلة من الصور في كل دقيقة 2 luciferin بعد الحقن. وكميا حجم الضوء المنبعث ورسوم بيانية لتحديد نقطة الكشف الأقصى (انظر المثال في الشكل 1B). مرة واحدة يتم تحديد موعد الكشف ضوء الحد الأقصى ، يجب على جميع الصور في تجربة استخدام نفس الوقت من التصوير بعد تلقيح luciferin ، كما في الشكل 1A. لدينا دراسات الحركيةأظهرت إشارة الذروة luciferase من كبد الفئران المصابة الرابع مع L. ط الشاغاسية بين 10 و 25 دقيقة بعد التلقيح luciferin IP (1B الشكل).
3. تقييم كفاءة التلقيح الطفيلي.
يمكن أن تستخدم لتقدير IVIS اتساق وكفاءة مع الإصابة الأولية ، معربا عن luciferase الليشمانية النيابة. طالما يتم استخدام نفس الطريق لكل حيوان ، ويمكن استخدام الفوتونات المنبعثة كتقدير تقريبي لفعالية التلقيح. ويظهر على سبيل المثال في الشكل 2 ، الذي تم تلقيح BALB / ج الفئران مع الأرقام المبينة للام metacyclic ط الشاغاسية promastigotes ، وهو نوع من visceralizing الليشمانيا. وكانت ساعة واحدة بعد تلقيح الفئران مع العدوى luciferin الملكية الفكرية ، وبعد 20 دقيقة والتقاط صور. هذا الرقم يدل على صورة بالأبيض والأسود وحدها (الشكل 2A) وصورة زائفة مضافين مع اللون التلألؤ (الشكل 2B). 2C الرقم يبين عدد من الفوتونات المنبعثة من مناطق مختارة من الفائدة (ROI) من الصور الماوس.
على سبيل المثال في الشكل 2 يوضح أن الجرعة العدوى طرديا مع تدرج من الفوتونات المنبعثة مع الأعداد المتزايدة من الطفيليات. وتظهر البيانات التي ، على غرار L. الرئيسية وL. المكسيكية ، والتصوير من الأمراض الجلدية مع SPP الليشمانيا. حساس جدا ، والسماح أقل من 10 4 الطفيليات أن تصور واضح. ويمكن استخدام مثل هذه البيانات لتحديد شدة الإصابة. في المثال هو موضح في الشكل 2B ، وهناك ما يقرب من 1 الفوتونات / ثانية / الطفيل.
4. رصد مسار عدوى لدى الفئران.
نماذج من الفئران الليشمانيا الجلدية استخدام مميز حجم الآفة كإجراء لمتابعة الإصابات طوليا. على الرغم من تقدير جيد من تطور المرض ، ويتأثر حجم الآفة من درجة الاستجابة الالتهابية بالإضافة إلى معدل تكرار الطفيلي في الأنسجة. يجب أن يتم التخلص الفئران في نهاية التجربة لقياس حمولة فعلا الطفيلي. يمكن أن تستخدم لتقدير IVIS تطور الأحمال الطفيلي طوليا في النسيج الجلدي من الفئران المصابة مع أنواع الليشمانيا الجلدية التي تسبب داء الليشمانيات. وقد تجلت في الشكل 3 ، طعمت BALB / ج الفئران تحت الجلد في اليوم 0 مع L. 5 10 معربا عن luciferase المكسيكية وتصويرها على بعد أسابيع متتابعة العدوى. معارض صور شخصية 3A ممثل في 10-31 أسابيع بعد الإصابة. وأظهرت البيانات نفسها في شكل كمي في 3B الشكل. الأهم من ذلك ، يمكن كميا عدد الطفيليات في موقع الإصابة IVIS قبل اكتشاف الآفة بطرق أخرى.
بمرور الوقت ، والزيادة التدريجية في تلألؤ بيولوجي يتوافق مع الزيادة في أعداد الطفيل. لا يمكن للقوة الإشارة ، أي الفوتونات / طفيلي / ثانية ، وتختلف وظيفة من أعداد الطفيل ، والموقع الأنسجة ، ومرحلة النمو والصحة الطفيلي في الجسم الحي. ولذلك فمن المهم لمعايرة العلاقة بين الطفيليات والتلألؤ قبل افتراض أن تلألؤ بيولوجي يتناسب طرديا مع أعداد الطفيل. في حالة L. الرئيسية 15 أو L. المكسيكية ، 16 يبدو أن هناك القليل نسبيا من التوهين تلألؤ بيولوجي في amastigotes ضمن قاطع الطريق بالنسبة للآفات promastigotes. البيانات الأولية تشير إلى أن توهين قد تكون أكثر عمقا للام الشاغاسية الطفلية 17 أو للام البرازيلية. 15
الشكل 1. حركية الكشف luciferase. أجري التحليل الحركي لتوزيع luciferin لتأسيس الوقت الأمثل لعدوى الليشمانية التصوير في الكبد. وكانت الفئران مصابة الرابع مع L. 7 10 ط الشاغاسية pIR1SAT لوك (A). أ) تم تصوير أربعة الفئران المصابة مع أحد الماوس المعافين بعد 5 أسابيع من العدوى. تم حقن Luciferin الملكية الفكرية في جميع الفئران الخمس وصور جمعت كل دقيقتين لمدة 24 دقيقة. وقد تم اختيار وقياس العائد على الاستثمار والتلألؤ كميا (B).
الشكل 2. تقييم كفاءة التلقيح الطفيلي. التصوير وقياس طفيليات الليشمانيا bioluminescent خلال العدوى مع IVIS. تم حقن من النوع البري BALB / ج الفئران intradermally في الجناح الأيمن السفلي مع HBSS (وهمية) أو المعدلة وراثيا أولا الليشمانية الشاغاسية L. ط الشاغاسية pIR1SAT لوك (A). ثم جرى تحليل الفئران مع ساعة واحدة التكنولوجيا IVIS التصوير بعد التلقيح. أ) لقد التقطت صورة فوتوغرافية بالأبيض والأسود من الفئران على الفور قبل ان تقاس إشارة الانارة (شدة الضوء). السهام الحمراء تشير إلى موقع الحقن على كلالحيوانات. ب) تم مضافين الصورة الزائفة لونا من التألق على الصورة. ج) تم تحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) (الدوائر الحمراء) وكان كميا والتألق في كل عائدات الاستثمار. تمثل البيانات التلألؤ صافي العائد على الاستثمار ROI المصابة ناقص وهمية من المصابين.
الشكل 3. على المدى الطويل مع المرض طفيل الليشمانيا الجلدية تسبب الإنسان دوام تقييم الدورة من عبء الطفيلية في حقن حيوان واحد مع bioluminescent الليشمانية المكسيكية pIR1SAT لوك (A). تم حقن وحشي من نوع BALB / ج الماوس تحت الجلد في العرقوب مع 100،000 ثابتة المرحلة المعدلة وراثيا الليشمانية المكسيكية pIR1SAT لوك (A). وقد تم جمع البيانات من الماوس IVIS المصابة على الرقم المبين في الأسابيع اللاحقة للعدوى. أ) كانت مضافين التضليليه الملونة صورا للالتلألؤ على صور فوتوغرافية بالأسود والأبيض من النقاط الزمنية المقابلة. ب) تم تحديد صافي العائد على الاستثمار عن طريق قياس التألق في العرقوب المصابة وطرح ROI الخلفية من رسوم بيانية والعرقوب وكان المقابل غير المصابة. المؤامرة مبعثر يمثل عائد الاستثمار الصافي في نقطة زمنية مختلفة بعد العدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الجسم الحي للنظام التصوير (IVIS) يوفر طريقة لتصوير الحيوان أو في الجسم الحي كله نماذج التصوير العدوى التجريبية لأشكال مختلفة من داء الليشمانيات. 18،16 وSPP الليشمانيا. ويمكن هندستها الطفيليات للتعبير عن يراعة luciferase على المستوى الذي يتم اكتشافه في الجسم الحي مع تكنولوجيا التصوير IVIS. واحدة من أهم مزايا هذا الأسلوب هو أنه يتيح لغير الغازية تصور SPP الليشمانيا. داخل الحيوانات الحية المضيفة. وقد تم تطبيق هذا الأسلوب لغيرها من نماذج الأمراض المعدية ، وذلك باستخدام العوامل المعدية التي يمكن التعبير عن الجينات المحورة. 19 20 علاوة على ذلك ، وقد استخدمت IVIS كنموذج لتقييم العلاج الدوائي للعدوى الليشمانية الكبيرة في جلد C57BL / 6 الفئران. 16،21
هناك بعض المحاذير والقيود المفروضة على أهمية هذا الأسلوب. يمكن أن تتأثر قوة الإشارة الضوئية الكشف عنها بواسطة كاميرا CCD من موقع الطفيليات داخل المضيف الثدييات ، من قبل قوة التعبير luciferase في الطفيليات ، من خلال توافر عوامل مشتركة للتفاعل أكسدة D - luciferin وامتصاص الضوء من الأنسجة الفوقية. وعلاوة على ذلك ، فإن قوة الإشارة في الكبد والطحال هو الأضعف على مستوى الفوتونات في طفيل في الثانية من إشارة في الجلد ، ويرجع ذلك من المحتمل أن إمدادات الدم عن طريق التبريد المحلية والأنسجة الفوقية. ويمكن استخدام القياس الكمي لالفوتونات المنبعثة مقارنة العدوى التدريجي في حيوان واحد على مر الزمن ، أو في النسيج نفسه بين الحيوانات (16). ولكن حتى المزيد من الأمثل ، وهذه المحاذير تحد من حساسية ، وبالتالي في جدوى أسلوب التقييم الكمي ل التهابات عميقة مع SPP visceralizing الليشمانيا. أخيرا ، وصور من المرجح أن تكون أضعف في سوداء (على سبيل المثال C57BL / 6) من الفئران في البيضاء (على سبيل المثال BALB / ج) الفئران. يمكن حلق الشعر قبالة الجلد المغطي للمجال الاهتمام تكون مفيدة في الكشف عن إشارة من الفئران السوداء.
اعتبارات إضافية هي بحاجة للتحقق من صحة IVIS كمقياس كمي للأحمال الطفيليات. وقد تم إجراء مقارنات بين المجهري ، وqPCR IVIS في حالات قليلة ، ولكن ستكون هناك حاجة مع كل نظام للتحقق من استخدام الأسلوب كمقياس لتطور المرض. 22 16 طرق جديدة للتصوير والناشئة ، والتي يمكن أن يقترن إلى صور تلألؤ بيولوجي (16). بالإضافة إلى الطفيليات المعدلة وراثيا ، يمكن هندستها يستضيف الحيوان للتعبير عن جزيئات bioluminescent أو الفلورسنت. يمكن أن الدراسات المستقبلية باستخدام هذه التقنية تشمل الحيوانات التعبير عن الجينات المحورة في مقصورات الخلوية محددة للكشف عن العوامل التي تشارك في استضافة والطفيليات المرضية في وقت واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المنحة مراجعة الاستحقاق من وزارة شؤون المحاربين القدامى ، من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة AI045540 ، AI067874 ، AI076233 - 01 وAI080801 (الوزارة) ، وAI29646 (SMB). تم تنفيذ العمل في جزء من التمويل خلال التصوير المقطعي وJG بواسطة T32 NIH AI07511.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin Potassium Salt | Reagent |  Caliper Life Sciences |
122796 | |
| IVIS Imaging System 200 Series | Equipment | Caliper Life Sciences |
Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum. |
References
- Capul, A. A., Barron, T., Dobson, D. E., Turco, S. J., Beverley, S. M. Two functionally divergent UDP-Gal nucleotide sugar transporters participate in phosphoglycan synthesis in Leishmania major. J Biol Chem. 282, 14006-14017 (2007).
- LeBowitz, J. H., Coburn, C. M., McMahon-Pratt, D., Beverley, S. M. Development of a stable Leishmania expression vector and application to the study of parasite surface antigen genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9736-9740 (1990).
- Mureev, S., Kushnir, S., Kolesnikov, A. A., Breitling, R., Alexandrov, K. Construction and analysis of Leishmania tarentolae transgenic strains free of selection markers. Mol Biochem Parasitol. 155, 71-83 (2007).
- Chakkalath, H. R. Priming of a beta-galactosidase (beta-GAL)-specific type 1 response in BALB/c mice infected with beta-GAL-transfected Leishmania major. Infect Immun. 68, 809-814 (2000).
- Sacks, D. L., Perkins, P. V. Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes. Science. 223, 1417-1419 (1984).
- da Silva, R., Sacks, D. L. Metacyclogenesis is a major determinant of Leishmania promastigote virulence and attenuation. Infect Immun. 55, 2802-2806 (1987).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99, 97-103 (2001).
- Scott, P., Caspar, P., Sher, A. Protection against Leishmania major in BALB/c mice by adoptive transfer of a T cell clone recognizing a low molecular weight antigen released by promastigotes. J Immunol. 144, 1075-1079 (1990).
- Belkaid, Y. The role of interleukin (IL)-10 in the persistence of Leishmania major in the skin after healing and the therapeutic potential of anti-IL-10 receptor antibody for sterile cure. J Exp Med. 194, 1497-1506 (2001).
- Wilson, M. E. Local suppression of IFN-gamma in hepatic granulomas correlates with tissue-specific replication of Leishmania chagasi. J Immunol. 156, 2231-2239 (1996).
- McElrath, M. J., Murray, H. W., Cohn, Z. A. The dynamics of granuloma formation in experimental visceral leishmaniasis. J Exp Med. 167, 1927-1937 (1988).
- Ato, M. Loss of dendritic cell migration and impaired resistance to Leishmania donovani infection in mice deficient in CCL19 and CCL21. J Immunol. 176, 5486-5493 (2006).
- Ahmed, S. Intradermal infection model for pathogenesis and vaccine studies of murine visceral leishmaniasis. Infect Immun. 71, 401-410 (2003).
- Kamala, T. Hock immunization: a humane alternative to mouse footpad injections. J Immunol Methods. 328, 204-214 (2007).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cell Microbiol. 7, 383-392 (2005).
- Brittingham, A., Miller, M. A., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Regulation of GP63 mRNA stability in promastigotes of virulent and attenuated Leishmania chagasi. Mol Biochem Parasitol. 112, 51-59 (2001).
- Roy, G. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Mol Biochem Parasitol. 110, 195-206 (2000).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Hardy, J., Margolis, J. J., Contag, C. H. Induced Biliary Excretion of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 74, 1819-1827 (2006).
- Lecoeur, H. Optimization of Topical Therapy for Leishmania major Localized Cutaneous Leishmaniasis Using a Reliable C57BL/6 Model. PLoS Negl Trop Dis. 1, e34-e34 (2007).
- Lang, T., Lecoeur, H., Prina, E. Imaging Leishmania development in their host cells. Trends Parasitol. 25, 464-473 (2009).
