Summary
Une
Abstract
Espèces distinctes de
Protocol
1. L'infection des animaux transgéniques petit Leishmania
1. Lignes parasites
Transgéniques Leishmania spp. les parasites exprimant la luciférase sont générés en utilisant une épisomique ou un vecteur d'intégration tel que rapporté. 1 2 lignées clonales sont préférés. Deux points importants sont:
(A) la luciférase intégré est préférable à la luciférase épisomale, puisque, en théorie, ces lignes parasites devraient mieux retenir le transgène en l'absence de pression médicamenteuse, c'est à dire après l'introduction dans un mammifère. Cependant, même transgènes intégrés peuvent être perdues à des taux bas, 3 il est donc essentiel pour maintenir la pression sélective des médicaments sur la culture mère. En pratique, Leishmania spp. conservent souvent des éléments épisomiques pendant des périodes prolongées, même in vivo, mais avec une variation du nombre de copies du plasmide par cellule. 4 Pour chaque type de parasite transgéniques, ils doivent toujours être transmis in vitro, une seule fois avant l'inoculation à des animaux pour éviter les effets de médicaments potentiels.
(B) Le spp Leishmania. les parasites peuvent perdre virulence pendant la culture in vitro. Chez certaines espèces (par exemple, L. donovani, L. infantum chagasi) cette perte peut survenir rapidement au cours des semaines de culture. Dans d'autres espèces (par exemple, L. major, L. mexicana) virulence est conservé à plus long terme, pendant des mois voire des années. Néanmoins, les transfectants clonale devraient être examinés afin d'identifier ceux qui la virulence conservant complète pour petits animaux. De nombreux laboratoires seront en série passent les parasites plusieurs reprises (4 ou plus) par les souris ou les hamsters pour augmenter la virulence avant de l'utiliser dans les expériences.
2. Préparation des parasites infectieux métacycliques stade de l'infection
La forme infectieuse de Leishmania spp. qui est transmise par la mouche de sable pour l'hôte mammifère est le promastigotes métacycliques. 5 Par conséquent, les infections des animaux avec cette forme du parasite sont préférés comme un modèle d'infection naturelle. Bien que les mouches des sables sont difficiles à maintenir, des parasites cultivés in vitro sera idéalement subir métacyclogenèse. Le pour cent de metacyclics présentes dans une culture varie avec le nombre de passages depuis l'isolement de l'animal, les milieux de culture et de l'espèce de parasite et de la souche.
Metacyclics peuvent être purifiés par sélection positive ou négative selon l'espèce et la ligne de Leishmania. Les changements dans le terminal ou les résidus de la chaîne latérale glucidique de la surface abondante lipophosphoglycane (GPL) de L. importants lui permettent d'être purifiée par la perte d'agglutination avec la lectine PNA (arachide agglutinine) 5,6. Autres espèces de Leishmania ou L. mutants majeurs manquent métacycliques GPL peut être purifié sur un gradient Ficoll étape 7. IVIS peut être réalisée à l'aide en vrac non purifié cultures, mais il faut reconnaître que ceux-ci contiennent un mélange de formes métacycliques et moins contagieux.
Typiquement, 15-20% de vrac phase stationnaire L. i. cultures chagasi sont récupérés comme metacyclics utilisant des parasites qui ont été isolées dans les 3 semaines à partir d'un hamster ou de souris. Les parasites sont lavés par centrifugation, suspendu à la concentration souhaitée dans le tampon (HBSS ou PBS avec ou sans Ca 2 + et Mg 2 +), et maintenu à 4 ° C pendant 2 heures avant l'inoculation à la souris.
3. Choix de l'itinéraire pour l'inoculation de Leishmania spp. dans l'hôte
Les manifestations cliniques de la maladie de la leishmaniose humaine varie selon les espèces de parasites et de facteurs de l'hôte. Il ya des différences correspondantes dans l'infection murin, les enquêteurs ont conduit à utiliser des modèles différents et des voies d'infection. Par exemple, les espèces causant CL humaine (par exemple L. major, L. mexicana, L. amazonensis) sont souvent inoculés à des souris par voie sous cutanée dans le coussinet plantaire ou intradermique dans l'oreille. 8,9 Espèces causant VL humains sont souvent introduites par voie intraveineuse par une queue veineuse 10-12 ou par voie intradermique dans l'oreille. 13 infections veine de la queue ont été réalisées soit avec du hamster dérivés amastigotes ou promastigotes. Nous avons régulièrement infecter des souris avec le formulaire de promastigotes de L. i. chagasi, soit par voie intradermique dans l'oreille ou latérale région du tarse 14 ou par voie intraveineuse.
4. Pré-traitement des souris avec des anesthésiques
Souris knockout de type sauvage, ou un gène transgénique peut être utilisé. Bien que n'étant pas formellement, quantifiés, il semble plus probable que les nus ou albinos, comme les souris BALB / c permettent une plus grande transmission de la lumière à travers les tissus par rapport à des souris à la peau foncée et les cheveux tels que les pigments C57BL / 6.
Injectable agents anesthésique comme un mélange de kétamine, plus xylazine [80-100 mg / kg + 10 mg / kg, respectivement, intrapreneurseritoneally (IP)] dilué dans une solution saline est une méthode préférée, puisque les animaux seront légèrement anesthésiés pendant au moins 10 minutes avec une seule dose. Volume total de 100 200ul est injecté IP en utilisant une aiguille de calibre 25-30. Les animaux sont manuellement retenue fermement par leur peau dorsale avec leur abdomen et la tête vers le bas. L'aiguille doit être positionnée avec le biseau vers le haut et légèrement inclinée. La pointe de l'aiguille doit pénétrer légèrement le quadrant inférieur gauche de la paroi abdominale.
Une inhalation comme l'isoflurane anesthésiante peut être utilisée en alternance, mais les animaux ne resteront sous anesthésie pour aussi longtemps qu'ils sont l'inhalation de l'agent anesthésique.
5. L'infection de souris par Leishmania spp. les parasites
Une fois que les animaux sont légèrement anesthésiés, les sites d'infection sont nettoyés avec de l'alcool éthylique ou isopropylique à 70%. La route des parasites des espèces, la dose et l'infection est déterminée par l'enquêteur. Le volume d'injection doit être minimisée pour éviter d'endommager les tissus excessifs pour intradermique (10 pi) ou intramusculaire (25-50 ul) les voies de l'infection. Les volumes d'injection chez la souris admissibles peuvent être plus grandes pour les intraveineuses (100-200 pi), sous-cutanée (jusqu'à 2 ml) ou intrapéritonéale (jusqu'à 2 ml) voies d'infection.
Voies d'infection et les volumes utilisés dans nos expériences comprennent intradermique dans le pavillon de l'oreille (10 pi), sous-cutanée dans le flanc (100-200 pi), intrapéritonéale (100-200 ul) ou intraveineuse (100-200 pi). Parasite doses ont varié de 10 février au 10 juillet promastigotes.
2. Bioluminescent imagerie de Leishmania en utilisant les IVIS (système d'imagerie in vivo)
1. Préparation de D-luciférine d'imagerie in vivo bioluminescents
D-luciférine (étrier LifeSciences) est reconstituée à une concentration de 15 mg / ml dans du PBS Dulbecco avec ou sans Mg 2 + et Ca 2 +, et d'une seringue filtrée (0,2 um). Des aliquotes sont congelés à -80 ° C jusqu'à utilisation. Avant l'injection, la luciférine est chauffé à 37 ° C dans un bain d'eau.
2. L'injection de D-luciférine
Le site d'injection est nettoyé et la luciférine est introduit dans des animaux conscients par une injection intrapéritonéale d'une de 15 mg / ml, solution de luciférine DPBS, à une dose de 150 mg / kg. Luciférine peut également être injecté dans l'anesthésie chez les animaux traités, mais la cinétique de bioluminescence peuvent varier légèrement.
Une fois injecté dans des animaux, la luciférine circule rapidement. Il est utile de déterminer empiriquement le meilleur moment pour acquérir des données luminescents après injection luciférine pour chaque modèle expérimental et pour différentes localisations anatomiques de la souris, parce que la cinétique de la distribution de luciférine peut varier. Une courbe cinétique est généré par l'acquisition d'une séquence d'images répliquer.
3. Les animaux sont légèrement anesthésiés
Anesthésiques inhalés ou injectable peut être utilisé pour la procédure d'imagerie. L'isoflurane est plus simple à administrer à ce stade, puisque la plupart des systèmes IVIS ont une chambre de l'anesthésie et le collecteur d'attachés cône d'anesthésie nez dans la chambre de l'imagerie. L'anesthésie est divisé entre la chambre de l'anesthésie et le collecteur intérieur de la chambre d'imagerie.
Les animaux sont placés dans la chambre de l'anesthésie en plexiglas transparent et légèrement anesthésiés avec isoflurane 2,5-3,5%. Les animaux sont surveillés visuellement pour assurer un degré efficace de l'anesthésie a été induite, et que leur respiration est libre. Degré suffisant de l'anesthésie est vérifiée par l'absence de retrait de la pression de patte douloureuse. Le montant de l'isoflurane peut être réduite à 1,5-2%, après les animaux sont légèrement anesthésiés.
4. Bioluminescent données sont collectées
Adéquatement les animaux anesthésiés sont transférés de la chambre de l'anesthésie à la chambre de l'imagerie et placé de sorte que les cônes le nez fixé sur le collecteur fournira un flux continu et régulé de l'isoflurane.
Le logiciel Living Image (Caliper Life Sciences) est ouvert et le IVIS est initialisé. Pour nos expériences, nous utilisons le système de Xenogen IVIS 200 (Caliper Life Sciences). La caméra CCD sera automatiquement refroidie et maintenue à la température appropriée, après l'initialisation de l'IVIS. La configuration du système de caméra et les paramètres d'acquisition d'image sont fixés dans le panneau de contrôle du système IVIS. Les paramètres d'acquisition sont largement basées sur le nombre d'animaux et de l'intensité de la bioluminescence. Les paramètres importants sont: le mode d'imagerie (luminescent ou fluorescent), temps d'exposition (le temps que l'obturateur est ouvert), binning (détermine la taille du pixel sur le capteur CCD), l'accent et la hauteur sujet (plan focal), f / arrêt (taille de l'ouverture) et champ de vision (FOV). Le FOV prédéfiniss (régions d'image carré) pour les système d'imagerie IVIS série 200 sont 4, 6,5, 13, 20 et 25 cm (largeur du champ de vision).
En appuyant sur l'acquisition ou acquérir les photos en continu dans la fenêtre de contrôle du système IVIS initie image et d'acquisition de données sur la IVIS. Les temps d'acquisition peut varier de quelques secondes à plusieurs minutes. Pour nos expériences, nous utilisons le 60 deuxième paramètre d'exposition par défaut.
Une image Close-up (petite FOV) peut fournir une meilleure résolution, mais pas nécessairement une sensibilité accrue par rapport à une image prise en utilisant un grand champ de vision.
Après la procédure d'imagerie, les animaux sont retirés de la chambre d'imagerie, remis dans leurs cages et surveillés jusqu'à ce qu'ils se remettre de l'anesthésie.
7. L'analyse des données
Les données de luminescence est analysé en utilisant le logiciel image vivante (Xenogen) et correspond à l'intensité lumineuse exprimée en nombre de photons détectés par la caméra CCD. Ces données sont représentées par une pseudo-image couleur qui est superposée sur une photographie en noir et blanc de l'animal. Les domaines spécifiques de l'image peuvent être analysés par la création de régions d'intérêt (ROI). Le logiciel Image Vivre ne fournissent une variété d'options de sortie de données. Une des façons les plus simples à analyser les données est de sélectionner une région d'intérêt (ROI) et de mesurer le nombre moyen de photons / seconde qui est détecté. Ces données peuvent ensuite être exportés vers un tableur comme Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation). GraphPad Prism (GraphPad Software) a été ensuite utilisé pour générer des graphiques de ce manuscrit.
3. Les résultats représentatifs
Résumé:
IVIS technologie permet la visualisation de la luciférase exprimant spp Leishmania. les parasites dans la vie anesthésiés souris Balb / c en temps réel. Une fois le substrat luciférine distribue à travers les tissus, l'oxydation rapide de D-luciférine par la luciférase exprimée par les parasites transgéniques provoque la lumière d'être émis. Les photons qui ne sont pas absorbés par les tissus sont détectées à la surface de l'animal par la caméra CCD de la technologie d'imagerie IVIS.
1. Modèles d'infection par des parasites causant la leishmaniose cutanée humaine viscérale par rapport humain.
Les modèles murins de la leishmaniose viscérale sont plus problématiques que les modèles de la leishmaniose cutanée, puisque la progression de l'infection nécessite l'euthanasie des groupes de souris à chaque point évalué. Une limitation de IVIS est que les émissions de lumière sont trempés à des degrés divers dans différents tissus viscéraux et des tissus à la circulation sanguine élevée tels que le foie et la rate peut être plus problématique que la peau. Par conséquent, IVIS peut-être pas aussi sensible pour la détection de la luciférase exprimant des parasites dans le foie et la rate comme dans la peau. Il est aussi conseillé que les charges parasitaires doivent pas être comparés entre les sites des tissus. Néanmoins, la charge parasitaire dans les mêmes tissus peuvent être comparés entre appariés selon l'âge des souris infectées de la même souche.
Le signal de la luciférase a été facilement détectés dans les organes viscéraux dans nos expériences, faciliter la comparaison des infections entre les animaux. Un exemple d'une infection de 5 semaines avec un parasite exprimant la luciférase causant la leishmaniose viscérale humaine, Li. chagasi SSU/IR1SAT-LUC (A), est montré dans la figure 1. Après 5 semaines de l'infection, des parasites visceralized peut être détecté dans le foie de toutes les souris et les rates de souris 1 et 2. La figure 2 montre une titration de la dose avec la ligne même parasite, une heure après l'introduction du parasite. Un exemple d'une infection par des parasites causant longitudinale leishmaniose cutanée humaine, L. mexicana SSU/IR1SAT-LUC (A), est montré dans la figure 3.
2. Cinétique de détection de la luciférase.
Préliminaires des études cinétiques sont essentiels pour maximiser la détection des photons émis par les parasites bioluminescentes. Il est important de déterminer ce empiriquement, comme l'imagerie en temps optimal variera probablement selon le nombre et la luminosité du parasite isoler et de la localisation anatomique des microorganismes luminescents chez la souris. Les études cinétiques sont dépendants du taux de distribution à travers les tissus luciférine, le tissu de souris exprimant la luciférase hébergeant Leishmania, et l'efficacité de la luciférase expression / activité enzymatique dans chaque parasite isoler. Les souris sont infectées et inoculés avec luciférine comme décrit ci-dessus, et une séquence d'images sont collectées toutes les 2 minutes après l'injection luciférine. L'ampleur de la lumière émise est quantifiée et graphique pour déterminer le point de détection maximale (voir exemple en figure 1B). Une fois le temps de détection de la lumière maximale est déterminée, toutes les images de l'expérience devrait utiliser le même temps de l'imagerie après l'inoculation de la luciférine, comme dans la Figure 1A. Nos études cinétiquesdémontré un signal de pointe luciférase à partir du foie de souris infectées avec L. IV i. chagasi entre 10 et 25 minutes après l'inoculation ip luciférine (figure 1B).
3. Évaluer l'efficacité de l'inoculation du parasite.
IVIS peuvent être utilisées pour estimer la cohérence et l'efficacité de l'infection initiale avec la luciférase exprimant Leishmania spp. Tant que la route est la même pour chaque animal, les photons émis peut être utilisé comme une estimation approximative de l'efficacité d'inoculation. Un exemple est montré dans la figure 2, dans lequel souris Balb / c ont été inoculées avec le nombre indiqué de métacycliques L. i. chagasi promastigotes, une espèce de Leishmania visceralizing. Une heure après l'infection des souris ont été inoculées avec ip luciférine, et après 20 minutes d'images ont été prises. La figure montre l'image en noir et blanc seul (figure 2A) et l'image superposée avec des pseudo-couleur de luminescence (Figure 2B). La figure 2C montre le nombre de photons émis par une région choisie d'intérêt (ROI) à partir des images de la souris.
L'exemple de la figure 2 montre que la dose infectieuse est directement proportionnelle à la gradation des photons émis par un nombre croissant de parasites. Les données montrent que, semblable à L. major et L. mexicana, l'imagerie des infections cutanées à Leishmania spp. est très sensible, permettant moins de 10 4 parasites d'être clairement visualisées. Les données telles que celles-ci peuvent être utilisées pour quantifier l'intensité de l'infection. Dans l'exemple montré dans la figure 2B, il ya environ 1 photons / s / parasite.
4. Suivi de l'évolution de l'infection chez la souris.
Les modèles murins de la leishmaniose cutanée caractéristique utilisent taille de la lésion comme une mesure de suivre les infections longitudinalement. Bien qu'une bonne estimation de la progression de la maladie, la taille des lésions est affectée par le degré de réponse inflammatoire en plus du taux de réplication du parasite dans les tissus. Les souris doivent être euthanasiés à la fin de l'expérience de mesurer effectivement la charge parasitaire. IVIS peuvent être utilisées pour estimer la progression des charges parasitaires longitudinalement dans le tissu cutané de souris infectées par Leishmania qui causent la leishmaniose cutanée. Démontrée dans la figure 3, souris Balb / c ont été inoculées par voie sous cutanée au jour 0 avec 10 5 L. mexicana exprimant la luciférase et imagé sur la semaine séquentielle après l'infection. La figure 3A montre des images représentant à 10-31 semaines après l'infection. Les mêmes données sont présentées sous forme quantitative dans la figure 3B. Fait important, le nombre de parasites sur le site de l'infection peut être quantifiée par IVIS avant la lésion est détectable par d'autres méthodes.
Au fil du temps, l'augmentation progressive de la bioluminescence correspond à une augmentation du nombre de parasites. La force du signal, à savoir les photons / parasite / seconde, peut varier en fonction du nombre de parasites, l'emplacement des tissus, la phase de croissance et de la santé du parasite in vivo. Il est donc important de calibrer la relation entre les parasites et de luminescence avant de supposer que la bioluminescence est directement proportionnelle au parasite numéros. Dans le cas de L. majeurs de 15 ou L. mexicana, 16 il semble y avoir une atténuation relativement peu de la bioluminescence dans les amastigotes dans les lésions du coussinet plantaire par rapport aux promastigotes. Des données préliminaires suggèrent que l'atténuation peut être plus profonde pour L. chagasi infantum 17 ou pour L. braziliensis 15.
Figure 1. Cinétique de détection de la luciférase. L'analyse cinétique de la distribution de luciférine a été réalisée pour établir le moment optimal pour l'imagerie Leishmania infection dans le foie. Les souris ont été infectées iv avec 10 7 L. i. chagasi pIR1SAT-LUC (A). A) Quatre souris infectées ont été imagées avec une souris non infectées après 5 semaines d'infection. Luciférine a été injecté par voie ip dans tous les cinq souris et les images ont été recueillies toutes les deux minutes pendant 24 minutes. ROI ont été sélectionnés et de luminescence a été mesurée et quantifiée (B).
Figure 2. Évaluer l'efficacité de l'inoculation du parasite. Imagerie et de quantifier bioluminescents leishmanies cours de l'infection avec IVIS. Wild-type de souris Balb / c ont été injectées par voie intradermique dans le bas du flanc droit avec HBSS (maquette) ou transgéniques Leishmania i. chagasi L. i. chagasi pIR1SAT-LUC (A). Les souris ont ensuite été analysées avec la technologie d'imagerie IVIS une heure après l'inoculation. A) Une photographie en noir et blanc de la souris a été prise juste avant le signal luminescent (intensité lumineuse) a été mesurée. Les flèches rouges pointer vers le site d'injection sur chaqueanimaux. B) L'image en fausses couleurs de la luminescence a été superposée sur la photo. C) les régions d'intérêt (ROI) ont été sélectionnés (cercles rouges) et la luminescence a été quantifiée dans chaque ROI. Les données représentent la luminescence net de ROI infectés, moins le retour sur investissement de maquette infectés.
Figure 3. L'évaluation des cours à long terme l'infection par un parasite causant la leishmaniose cutanée humaine. Temps de charge parasitaire chez un seul animal injecté avec bioluminescents Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A). Un type sauvage souris BALB / c ont été injectés par voie sous cutanée dans le jarret avec 100.000 phase stationnaire transgéniques Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A). IVIS données ont été recueillies à partir de la souris infectées au nombre indiqué de semaines après l'infection. A) Les pseudo-images en couleur de la luminescence ont été superposées sur des photos noir et blanc à partir de points de temps correspondant. B) Le retour sur investissement net a été déterminée en mesurant la luminescence dans le jarret infectés et en soustrayant le ROI de fond à partir du jarret controlatéral non infecté a été tracée. Le nuage de points représente un retour sur investissement net à divers moments après l'infection.
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Discussion
Le système d'imagerie in vivo (IVIS) fournit une méthode pour l'imagerie des animaux entiers ou dans des modèles d'imagerie in vivo l'infection expérimentale de différentes formes de leishmaniose. 18,16 Le spp Leishmania. parasites peuvent être modifiées pour exprimer la luciférase de luciole à un niveau qui est détectée in vivo avec la technologie d'imagerie IVIS. Un des principaux avantages de cette méthode est qu'elle permet aux non-invasive de visualisation de Leishmania spp. l'intérieur de l'hôte animal vivant. Cette méthode a été appliquée à d'autres modèles de maladies infectieuses, en utilisant des agents infectieux qui peuvent exprimer des transgènes. 19 20 Par ailleurs, IVIS a été utilisé comme un modèle pour évaluer un traitement médicamenteux de Leishmania infection majeure dans la peau des souris C57BL / 6. 16,21
Il ya quelques mises en garde et limites de cette méthode. La force du signal lumineux détecté par la caméra CCD peut être affectée par la localisation des parasites dans l'hôte mammifère, par la force d'expression de la luciférase dans les parasites, par la disponibilité des co-facteurs de la réaction d'oxydation du D-luciférine et par absorption de la lumière par les tissus sus-jacente. Par ailleurs, la force du signal dans le foie et la rate est plus faible au niveau de photons par des parasites par seconde que le signal de la peau, probablement due à une trempe par l'offre locale de sang et les tissus recouvrant. Quantification des photons émis peuvent être utilisés pour comparer l'infection progressive chez un seul animal au fil du temps, ou dans le même tissu entre les animaux. 16 Toutefois, jusqu'à encore optimisé, ces réserves seront limiter la sensibilité et donc l'utilité de la méthode d'évaluation quantitative des infections profondes avec le visceralizing spp Leishmania. Enfin, les images sont susceptibles d'être faibles en noir (par exemple, C57BL / 6) chez les souris que dans le blanc (par exemple, BALB / c) les souris. Rasage de la peau recouvrant les cheveux de la zone d'intérêt peut être utile pour détecter le signal de la souris noire.
D'autres considérations sont la nécessité de valider les IVIS comme une mesure quantitative de la charge parasitaire. Les comparaisons entre la microscopie, qPCR et IVIS ont été faites dans quelques cas, mais il fallait que chaque système afin de valider l'utilisation de la méthode comme une mesure de la progression de la maladie. 22 16 De nouvelles méthodes d'imagerie sont émergents, ce qui pourrait être couplé à images de bioluminescence. 16 En plus des parasites transgéniques, les animaux hôtes peuvent être modifiées pour exprimer des molécules bioluminescent ou fluorescent. Les futures études utilisant cette technique pourrait inclure les animaux exprimant des transgènes dans des compartiments cellulaires afin de détecter les facteurs de l'hôte impliqués dans la pathogenèse et parasites simultanément.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par une subvention d'examen du mérite du ministère des Anciens Combattants, par des subventions du NIH AI045540, AI067874, AI076233-01 et AI080801 (MEW), et par AI29646 (SMB). Le travail a été effectué en partie au cours de financement du CT et JG par le NIH T32 AI07511.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin Potassium Salt | Reagent |  Caliper Life Sciences |
122796 | |
| IVIS Imaging System 200 Series | Equipment | Caliper Life Sciences |
Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum. |
References
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