Summary
Un
Abstract
Specie diverse di
Protocol
1. L'infezione di piccoli animali transgenici con Leishmania
1. Parasite linee
Transgenici Leishmania spp. parassiti che esprimono luciferasi vengono generate utilizzando un episomiale o un vettore di integrazione, come riportato. 1 2 linee clonale sono preferiti. Due punti importanti sono:
(A) luciferasi integrato è preferibile luciferasi episomiale, dal momento che in teoria queste righe parassita deve conservare meglio il transgene in assenza di pressione di droga, cioè dopo l'introduzione in un mammifero. Transgeni Tuttavia, anche integrata può essere persa a tassi bassi, 3 ed è quindi fondamentale per mantenere la pressione selettiva della droga sulla coltura madre. In pratica, Leishmania spp. spesso conservano elementi episomiale per periodi prolungati, anche in vivo, anche se con variazioni di numero di copie del plasmide per cellula. 4 Per entrambi i tipi di transgenici parassita, dovrebbero sempre essere passati in vitro una sola volta prima di inoculazione in animali al fine di evitare potenziali effetti della droga.
(B) La Leishmania spp. parassiti può perdere virulenza durante la coltura in vitro. In alcune specie (ad esempio L. donovani, L. infantum chagasi), questa perdita può avvenire rapidamente nel corso di settimane di cultura. In altre specie (ad esempio, L. importanti, L. mexicana) virulenza viene mantenuta a lungo termine, per mesi o anni. Tuttavia, trasfettate clonale dovrebbero essere sottoposti a screening per identificare i virulenza mantenendo completo per piccoli animali. Molti laboratori in serie passano i parassiti più volte (4 o più) attraverso topi o criceti per aumentare virulenza prima di utilizzare negli esperimenti.
2. Preparazione di parassiti metacyclic stadio infettivo per l'infezione
La forma infettiva di Leishmania spp. che viene trasmessa dalla mosca della sabbia per l'host dei mammiferi è il promastigote metacyclic. 5 Perciò, le infezioni degli animali con questa forma del parassita sono preferite come un modello di infezione naturale. Anche se flebotomi sono difficili da mantenere, parassiti coltivate in vitro saranno opportunamente sottoposto metacyclogenesis. La percentuale di metacyclics presenti in una cultura varia a seconda del numero di passaggi da quando isolamento dal animale, i media della cultura e delle specie parassita e di deformazione.
Metacyclics può essere purificato dalla selezione positiva o negativa a seconda della specie e la linea di Leishmania. Cambiamenti nel terminale o laterale residui catena glucidica della superficie lipophosphoglycan abbondante (GPL) di L. principali permettono di essere purificata dalla perdita di agglutinazione con la lectina PNA (arachidi agglutinina). 5,6 Altre specie di Leishmania o L. mutanti privi principali metacyclic GPL può essere purificato su un gradiente di Ficoll passo 7. IVIS possono essere eseguite utilizzando massa non depurati culture, ma bisogna riconoscere che questi contengono una miscela di metacyclic e forme meno infettive.
Tipicamente, il 15-20% della fase stazionaria L. massa i. culture chagasi sono recuperati come metacyclics utilizzando parassiti che sono stati isolati entro 3 settimane da un criceto o un mouse. I parassiti vengono lavati per centrifugazione, sospeso fino alla concentrazione desiderata in tampone (HBSS o PBS, con o senza Ca 2 + e Mg 2 +), e mantenuto a 4 ° C per un massimo di 2 ore prima dell'inoculazione nel mouse.
3. Scelta del percorso per l'inoculazione di Leishmania spp. nell'ospite
Le manifestazioni cliniche della malattia leishmaniosi umana variano a seconda sia la specie di parassita e fattori dell'ospite. Ci sono differenze corrispondenti a infezione murino, gli investigatori portando ad un uso diversi modelli e percorsi di infezione. Per esempio, le specie che causano CL umana (ad esempio L. importanti, L. mexicana, L. amazonensis) sono spesso inoculati in topi per via sottocutanea nella zampa o intradermica nell'orecchio. 8,9 Specie causando VL umani sono spesso introdotti per via endovenosa attraverso una coda 10-12 vena o per via intradermica nella spiga. 13 infezioni vena di coda sono stati effettuati sia con criceto derivati amastigoti o con promastigoti. Noi abitualmente infettare i topi con la forma promastigote di L. i. chagasi, sia intradermica nell'orecchio o laterale regione tarso 14 o per via endovenosa.
4. Pre-trattamento dei topi con anestetico
Topi knockout wild-type, transgenici o gene può essere utilizzato. Anche se non formalmente, quantificati, sembra molto probabile che nude o albino come topi BALB / c consentire una maggiore trasmissione della luce attraverso il tessuto rispetto ai topi con la pelle scura e pigmento dei capelli come C57BL / 6.
Iniettabili agenti anesthestic come una miscela di ketamina più xylazina [80-100 mg / kg + 10 mg / kg, rispettivamente, intraperitoneally (ip)] diluito in soluzione salina è un metodo preferito, dal momento che gli animali saranno leggermente anestetizzati per almeno 10 minuti con una singola dose. 100-200ul volume totale viene iniettato ip con un 25-30 gauge. Gli animali sono manualmente trattenuti saldamente dai loro pelle dorsale con l'addome e la testa verso il basso. L'ago deve essere posizionato con lo smusso e leggermente angolata. La punta dell'ago deve solo leggermente penetrare il quadrante in basso a sinistra della parete addominale.
Un inalanti come anestetico isoflurano possono essere usati in alternativa, ma gli animali solo rimanere sotto anestesia per tutto il tempo in cui sono inalando l'agente anestetico.
5. L'infezione di topi con Leishmania spp. parassiti
Una volta che gli animali sono leggermente anestetizzati, i siti di infezione sono puliti con 70% di alcol etilico o isopropilico. Il percorso parassita specie, la dose e l'infezione è determinata dallo sperimentatore. Il volume di iniezione deve essere ridotto al minimo per evitare danni eccessivi dei tessuti per via intradermica (10 microlitri) o intramuscolare (25-50 mL) percorsi infezione. I volumi di iniezione ammissibile nei topi può essere più grande per via endovenosa (100-200 mL), per via sottocutanea (fino a 2 ml) o intraperitoneale (fino a 2 ml) Vie di infezione.
Vie di infezione e volumi utilizzati nei nostri esperimenti includono intradermica nel padiglione auricolare (10 microlitri), per via sottocutanea nel fianco (100-200 mL), intraperitoneale (100-200 mL) o endovenosa (100-200 mL). Dosi parassita hanno spaziato dal 2 Ottobre - 7 Ottobre promastigoti.
2. Bioluminescenti immagini di Leishmania utilizzando il IVIS (nel sistema di imaging in vivo)
1. Preparazione di D-luciferina per l'imaging in vivo bioluminescenti
D-Luciferin (Caliper LifeSciences) è ricostituito ad una concentrazione di 15 mg / ml in PBS Dulbecco, con o senza Mg 2 + e Ca 2 +, e la siringa filtrata (0,2 micron). Aliquote sono congelati a -80 ° C fino al momento dell'uso. Prima dell'iniezione, luciferina viene riscaldato a 37 ° C in un bagno d'acqua.
2. L'iniezione di D-luciferina
Il sito di iniezione viene pulita e luciferina viene introdotto in animali coscienti da un'iniezione intraperitoneale di 15 mg / ml soluzione di luciferina in DPBS, alla dose di 150 mg / kg. Luciferina può anche essere iniettato in anestesia animali trattati, ma la cinetica bioluminescenza può variare leggermente.
Una volta iniettate in animali, luciferina circola rapidamente. E 'utile per determinare empiricamente il momento ottimale per l'acquisizione dati luminescenti dopo l'iniezione luciferina per ogni modello sperimentale e per le diverse sedi anatomiche dei topi, perché la cinetica di distribuzione luciferina può variare. Una curva cinetica è generata attraverso l'acquisizione di una sequenza di immagini replicare.
3. Gli animali sono leggermente anestetizzati
Inalanti o anestetici iniettabili possono essere utilizzati per la procedura di imaging. Isoflurano è più semplice da gestire in questa fase, poiché la maggior parte dei sistemi IVIS avere una camera collegata anestesia e naso molteplici anestesia cono all'interno della camera di imaging. L'anestesia è diviso tra la camera di anestesia e il collettore all'interno della camera di imaging.
Gli animali vengono inseriti nella camera di plexiglass trasparente anestesia e leggermente anestetizzati con isoflurano 2,5-3,5%. Gli animali sono visivamente monitorato per garantire un grado effettivo di anestesia è stata indotta, e che il loro respiro è libero. Sufficiente grado di anestesia è verificata dalla mancanza di ritiro dalla pressione zampa dolorosa. La quantità di isoflurano può essere ridotto a 1,5-2%, dopo gli animali sono leggermente anestetizzati.
4. Bioluminescenti dati vengono raccolti
Gli animali vengono trasferiti adeguatamente anestetizzato dalla camera di anestesia alla camera di imaging e posizionato in modo che i coni naso attaccato al collettore consegnerà un flusso continuo e regolamentato di isoflurano.
L'immagine del programma Living software (Caliper Life Sciences) è aperta e il IVIS viene inizializzato. Per i nostri esperimenti, usiamo il Xenogen IVIS 200 sistema (Caliper Life Sciences). La camera CCD viene automaticamente raffreddato e mantenuto alla temperatura appropriata dopo l'inizializzazione del IVIS. La configurazione del sistema della fotocamera e parametri di acquisizione dell'immagine vengono impostate nel Pannello di controllo Sistema IVIS. I parametri di acquisizione sono in gran parte in base al numero di animali e l'intensità della bioluminescenza. Parametri importanti sono: la modalità di imaging (luminescenti o fluorescenti), tempo di esposizione (tempo che l'otturatore è aperto), binning (determina la dimensione dei pixel sul CCD), messa a fuoco e l'altezza del soggetto (piano focale), f / stop (dimensione di apertura) e il campo visivo (FOV). Il preset FOVs (regioni immagine quadrati) per la IVIS Imaging System serie 200 sono 4, 6,5, 13, 20 e 25 cm (larghezza FOV).
Premendo acquisire o acquisire foto continuo nella finestra di controllo del sistema IVIS avvia immagine e di acquisizione dati sul IVIS. Tempi di acquisizione può variare da pochi secondi fino a diversi minuti. Per i nostri esperimenti, usiamo il 60 secondo impostazione dell'esposizione di default.
A Close-up immagine (piccolo FOV) possono fornire una maggiore risoluzione, ma non necessariamente una maggiore sensibilità rispetto a una immagine ripresa con un campo visivo più ampio.
Dopo la procedura di imaging, gli animali vengono rimossi dalla camera di imaging, tornati alle loro gabbie e monitorati fino a quando il recupero dall'anestesia.
7. Analisi dei dati
I dati di luminescenza viene analizzato utilizzando il software immagine vivente (Xenogen) e corrisponde all'intensità della luce espressa come il numero di fotoni rilevati dalla fotocamera CCD. Questi dati sono rappresentati da una pseudo-colore immagine che viene sovrapposta ad una fotografia in bianco e nero degli animali. Aree specifiche dell'immagine può essere analizzata attraverso la creazione di regioni di interesse (ROI). Il software Image Vivere fornisce una varietà di opzioni di output dei dati. Uno dei modi più semplici per analizzare i dati è quello di selezionare una regione di interesse (ROI) e misurare la media # di fotoni / secondo che viene rilevato. Questi dati possono poi essere esportati in un foglio elettronico come Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation). GraphPad Prism (GraphPad Software) è stato successivamente utilizzato per generare grafici di questo manoscritto.
3. Rappresentante Risultati
Sommario:
IVIS tecnologia consente la visualizzazione di luciferasi che esprimono Leishmania spp. parassiti che vivono anestetizzati topi BALB / c in tempo reale. Una volta che il substrato luciferina distribuisce attraverso i tessuti, l'ossidazione rapida di D-luciferina luciferasi da espresso dai parassiti transgenici cause luce per essere emessa. I fotoni che non vengono assorbite dal tessuto vengono rilevati sulla superficie dell'animale dalla telecamera CCD della tecnologia di imaging IVIS.
1. Modelli di infezione da parassiti che causano la leishmaniosi cutanea umana viscerale contro umani.
Modelli murini di leishmaniosi viscerale sono più problematici rispetto ai modelli di leishmaniosi cutanea, dato che la progressione dell'infezione richiede l'eutanasia di gruppi di topi in ogni fase di valutazione. Una limitazione di IVIS è che le emissioni sono spegne la luce in misura diversa nei diversi tessuti viscerali e tessuti con alto flusso di sangue come il fegato e la milza possono essere più problematico rispetto alla pelle. Pertanto, IVIS potrebbe non essere così sensibile per la rilevazione di luciferasi che esprimono parassiti nel fegato e milza, come nella pelle. E 'inoltre consigliabile che i carichi parassiti non deve essere confrontata tra i siti dei tessuti. Tuttavia, i carichi parassita nei tessuti stessi possono essere confrontati tra di pari età topi infettati dello stesso ceppo.
Il segnale luciferasi è stato prontamente rilevato negli organi viscerali nei nostri esperimenti, facilitare il confronto delle infezioni tra gli animali. Un esempio di di 5 settimane infezione con un luciferasi che esprimono parassita che causa la leishmaniosi viscerale umana, Li. chagasi SSU/IR1SAT-LUC (A), è mostrata in Figura 1. Dopo 5 settimane di infezioni, parassiti visceralized può essere rilevato nel fegato di tutti i mouse e nella milza di topi 1 e 2. La Figura 2 mostra una titolazione della dose con la linea parassita stesso, un'ora dopo l'introduzione del parassita. Un esempio di una infezione longitudinale con parassiti che causano la leishmaniosi cutanea dell'uomo, L. mexicana SSU/IR1SAT-LUC (A), è mostrata in Figura 3.
2. Cinetica di rilevazione luciferasi.
Studi preliminari cinetici sono essenziali per massimizzare la rilevazione di fotoni emessi dai parassiti bioluminescenti. E 'importante per determinare questo empiricamente, come il tempo di imaging ottimale probabile che variano a seconda del numero e della luminosità del parassita isolare e dalla localizzazione anatomica dei microrganismi luminescenti nei topi. Gli studi cinetici dipendono dal tasso di distribuzione in tutto luciferina tessuti, il tessuto del mouse ospitare luciferasi che esprimono Leishmania, e l'efficienza della luciferasi espressione / attività enzimatica in ogni parassita isolare. I topi sono infetti e inoculati con luciferina come descritto sopra, e una sequenza di immagini viene raccolto ogni 2 minuti dopo l'iniezione luciferina. L'entità della luce emessa è quantificato e grafico per determinare il punto di rilevamento massima (vedi esempio in Figura 1B). Una volta che il tempo di rilevamento della luce massima è determinato, tutte le immagini durante l'esperimento dovrebbe utilizzare il tempo stesso delle immagini dopo l'inoculazione di luciferina, come mostrato nella Figura 1A. I nostri studi cineticidimostrato un segnale di picco luciferasi dal fegato di topi infettati con L. iv i. chagasi tra i 10 ei 25 minuti dopo l'inoculazione ip luciferina (Figura 1B).
3. Valutare l'efficienza di inoculazione del parassita.
IVIS può essere utilizzato per stimare la coerenza e l'efficacia di infezione iniziale con luciferasi che esprimono Leishmania spp. Finché lo stesso percorso viene utilizzato per ogni animale, i fotoni emessi può essere usata come una stima approssimativa di efficacia inoculazione. Un esempio è mostrato nella Figura 2, in cui topi BALB / c sono stati inoculati con i numeri indicati di metacyclic L. i. chagasi promastigoti, visceralizing una specie di Leishmania. Un'ora dopo l'infezione topi sono stati inoculati con ip luciferina, e dopo 20 minuti le immagini sono state scattate. La figura mostra l'immagine in bianco e nero da solo (Figura 2A) e l'immagine sovrapposta con pseudo-color luminescenza (Figura 2B). Figura 2C mostra il numero di fotoni emessi da regioni scelti d'interesse (ROI) dalle immagini del mouse.
L'esempio in figura 2 dimostra che la dose di infezione è direttamente proporzionale alla gradazione di fotoni emessi con un numero crescente di parassiti. I dati mostrano che, simile a L. importanti e L. mexicana, l'imaging di infezioni cutanee con Leishmania spp. è molto sensibile, permettendo meno di 10 4 parassiti essere chiaramente visualizzato. Dati come questi possono essere usati per quantificare l'intensità delle infezioni. Nell'esempio mostrato nella Figura 2B, ci sono circa 1 fotoni / sec / parassita.
4. Monitoraggio del decorso dell'infezione di topi.
Modelli murini di leishmaniosi cutanea caratteristica dimensione della lesione utilizzare come misura per seguire le infezioni longitudinalmente. Anche se una buona stima di progressione della malattia, dimensione della lesione è influenzata dal grado di risposta infiammatoria in aggiunta al tasso di replicazione parassita nei tessuti. I topi devono essere eutanasia alla fine di questo esperimento per misurare effettivamente il carico parassita. IVIS può essere utilizzato per stimare la progressione dei carichi parassita longitudinalmente nel tessuto cutaneo dei topi infettati con specie di Leishmania che causano la leishmaniosi cutanea. Mostrato nella Figura 3, topi BALB / c sono stati inoculati per via sottocutanea al giorno 0 con 10 5 L. mexicana esprimendo luciferasi e ripreso sulle settimane sequenziale dopo l'infezione. Figura 3A mostra immagini rappresentative a 10-31 settimane dopo l'infezione. Gli stessi dati sono mostrati in forma quantitativa in Figura 3B. È importante sottolineare che il numero dei parassiti nella sede di infezione può essere quantificata IVIS prima di una lesione è rilevabile da altri metodi.
Col tempo, il progressivo aumento della bioluminescenza corrisponde ad un aumento del numero di parassiti. La potenza del segnale, cioè fotoni / parassita / secondo, può variare in funzione del numero di parassiti, l'ubicazione dei tessuti, fase di crescita e la salute dei parassiti in vivo. E 'quindi importante per calibrare il rapporto tra parassiti e luminescenza prima di assumere che bioluminescenza è direttamente proporzionale al numero di parassiti. Nel caso di L. maggiori 15 o L. mexicana, 16 sembra esserci attenuazione relativamente poco di bioluminescenza in amastigoti all'interno di lesioni zampa rispetto a promastigoti. Dati preliminari suggeriscono che l'attenuazione può essere più profonda per L. chagasi infantum 17 o per L. braziliensis 15.
Figura 1. Cinetica di rilevazione luciferasi. Analisi cinetica di distribuzione luciferina è stata effettuata per stabilire il momento ottimale per l'infezione di imaging Leishmania nel fegato. I topi sono stati infettati con iv 10 7 L. i. chagasi pIR1SAT-LUC (A). A) Quattro topi infettati erano ripreso insieme a un mouse non infetti dopo 5 settimane di infezione. Luciferina è stato iniettato ip in tutti e cinque i topi e le immagini sono stati raccolti ogni due minuti per 24 minuti. ROI sono stati selezionati e luminescenza è stata misurata e quantificata (B).
Figura 2. Valutare l'efficienza di inoculazione del parassita. Imaging e quantificare bioluminescenti parassiti Leishmania durante l'infezione con IVIS. Wild-type topi BALB / c sono stati iniettati per via intradermica nel fianco in basso a destra con HBSS (finta) o transgenici Leishmania i. chagasi L. i. chagasi pIR1SAT-LUC (A). I topi sono stati poi analizzati con la tecnologia di imaging IVIS un'ora dopo l'inoculazione. A) Una fotografia in bianco e nero dei topi è stata presa immediatamente prima del segnale luminescente (intensità della luce) è stata misurata. Le frecce rosse indicano il sito di iniezione per ognianimale. B) La pseudo-colore immagine della luminescenza era sovrapposto sulla fotografia. C) Le regioni di interesse (ROI) sono stati selezionati (cerchi rossi) e la luminescenza è stata quantificata in ogni ROI. I dati rappresentano la luminescenza netto di ROI infetti meno il ROI di mock infetti.
Figura 3. A lungo termine l'infezione con un parassita che causa la leishmaniosi cutanea umana. Tempo valutazione del corso da soma parassitaria in un singolo animale iniettato bioluminescenti Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A). Una wild-type BALB / c topo è stato iniettato per via sottocutanea nella garretto con 100.000 stazionaria fase transgenici Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC (A). IVIS dati sono stati raccolti dal mouse infetti al numero indicato di settimane dopo l'infezione. A), Pseudo-colore le immagini della luminescenza sono stati sovrapposti su fotografie in bianco e nero da punti di tempo corrispondente. B) Il ROI netto è stato determinato misurando luminescenza del garretto infetto e sottrarre il ROI di fondo dal garretto controlaterale non infetti è stata tracciata. Il grafico rappresenta il ROI netta in vari momenti dopo l'infezione.
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Discussion
Il sistema di imaging in vivo (IVIS) fornisce un metodo per l'imaging animale intero o in vivo modelli sperimentali di infezione di imaging diverse forme di leishmaniosi. 18,16 La Leishmania spp. parassiti può essere progettato per esprimere la luciferasi lucciola a un livello che viene rilevato in vivo con la tecnologia di imaging IVIS. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che permette non invasivo visualizzazione di Leishmania spp. dentro l'ospite animale vivo. Questo metodo è stato applicato ad altri modelli di malattie infettive, con agenti infettivi che possono esprimere i transgeni. 19 20 Inoltre, IVIS è stato utilizzato come modello per valutare la terapia farmacologica dell'infezione da Leishmania importanti nella pelle di C57BL / 6 topi. 16,21
Ci sono alcune cose importanti e limiti di questo metodo. La forza del segnale luminoso rilevati dalla fotocamera CCD può essere influenzata dalla posizione dei parassiti all'interno dell'ospite mammifero, con la forza di espressione luciferasi nel parassiti, dalla disponibilità di co-fattori per la reazione di ossidazione di D-luciferina e assorbimento della luce da parte dei tessuti sovrastanti. Inoltre, la potenza del segnale in fegato e milza è più debole a livello di fotoni per parassita al secondo rispetto al segnale nella pelle, probabilmente a causa tempra da afflusso di sangue locale e dei tessuti sovrastanti. Quantificazione dei fotoni emessi può essere usato per confrontare l'infezione progressiva in un singolo animale nel corso del tempo, o nello stesso tessuto tra animali. 16 Tuttavia fino ulteriormente ottimizzato, questi avvertimenti limiterà la sensibilità e quindi l'utilità del metodo di valutazione quantitativa del infezioni profonde con la visceralizing Leishmania spp. Infine, le immagini sono suscettibili di essere più debole in nero (ad esempio C57BL / 6) che nei topi bianchi (ad esempio BALB / c) nei topi. Rasatura la pelle i capelli a sovrastante l'area di interesse può essere utile per individuare il segnale proveniente da topi neri.
Ulteriori considerazioni sono la necessità di convalidare il IVIS come una misura quantitativa dei carichi parassita. I confronti tra microscopia, qPCR e IVIS sono stati fatti in alcuni casi, ma sarebbe necessario con ogni sistema per convalidare l'utilizzo del metodo come una misura della progressione della malattia. 22 16 nuovi metodi per l'imaging stanno emergendo, che potrebbe essere accoppiato al immagini bioluminescenza. 16 Oltre ai parassiti transgenici, ospita animale può essere progettato per esprimere molecole bioluminescenti o fluorescenti. Studi futuri con questa tecnica potrebbe includere gli animali che esprimono transgeni in specifici comparti cellulari per rilevare fattori dell'ospite coinvolti nella patogenesi e parassiti contemporaneamente.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato in parte da una borsa di studio al merito recensione dal Department of Veterans Affairs, da sovvenzioni NIH AI045540, AI067874, AI076233-01 e AI080801 (MEW), e da AI29646 (SMB). Il lavoro è stato svolto in parte durante finanziamento di CT e JG dal NIH T32 AI07511.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin Potassium Salt | Reagent |  Caliper Life Sciences |
122796 | |
| IVIS Imaging System 200 Series | Equipment | Caliper Life Sciences |
Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum. |
References
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