Summary
Deze video toont de orthotope aorta transplantatie model als een eenvoudig model om de ontwikkeling van transplantatie vasculopathie (TVP) studie bij ratten.
Abstract
Onderzoek modellen van chronische afstoting zijn essentieel voor pathobiological en pathofysiologische processen te onderzoeken tijdens de ontwikkeling van de transplantatie vasculopathie (TVP).
De meest gebruikte diermodel voor hart-en chronische afstoting studies is het heterotope harttransplantatie model uitgevoerd in het laboratorium knaagdieren. Dit model wordt veel gebruikt in experimenten, omdat Ono en Lindsey (3) publiceerden hun techniek. Voor het analyseren van de bevindingen in de bloedvaten, het hart moet worden coupes en alle schepen moeten worden gemeten.
Een andere methode om chronische afstoting te onderzoeken in cardiovasculaire ondervragingen is de aorta transplantatie model (1, 2). In de orthotope aorta transplantatie model, kan de aorta gemakkelijk histologisch geëvalueerd worden (2). De PVG-to-ACI model is vooral nuttig voor CAV studies, omdat acute vasculaire afstoting is geen belangrijke storende factor en ciclosporine A (CsA) behandeling belet niet dat de ontwikkeling van CAV, vergelijkbaar met wat we vinden in de klinische setting (4 ). A7-dagen periode van CsA is vereist in dit model van acute afstoting te voorkomen en om overleving op lange termijn te bereiken met de ontwikkeling van TVP.
Dit model kan ook gebruikt worden om acute cellulaire afstoting en media necrose in xenogene modellen (5) te onderzoeken.
Protocol
Ratten met een gewicht van ongeveer 250-300g worden gekocht van Charles River (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld).
Transplantaties worden uitgevoerd met behulp van PVG ratten als donoren, en ACI ratten als ontvangers.
Ratten zijn gehuisvest onder gangbare condities, gevoed standaard rat chow en water ad libidum.
Alle chirurgische instrumenten zijn gesteriliseerd.
Donor voorbereiding:
Verdoven rat met isofluraan (2,5-3%) met behulp van een inductie kamer.
- Scheren van de buik-en borstkas haar en plaats de rat op zijn rug en zet een masker over zijn neus en mond te houden van de anesthesie.
- Ontsmet de buik-en borstkas gebied op grote schaal gebruik van Provo-Jodium, naast het gebruik 80% ethanol, herhaalt u deze stap drie keer.
- Controleer reflexen knijpen de achterpoten voeten om er zeker van dat de rat voldoende anesthesized.
- Exsanguinate de rat door het openen van de buik en het snijden van een gat in de abdominale aorta.
- Voorzichtig openen van de thorax aan de thoracale aorta te vinden.
- Ontleden de thoracale aorta uit de omliggende weefsels zoals vet, de zenuwen en de slokdarm.
- Trekken een 1,5 cm stuk van de aorta met behulp van een Couter, zonder beschadiging van het weefsel van de aorta.
- Grondig perfuseren de aorta transplantaat met koude steriele zoutoplossing en bewaar het transplantaat bij 4 ° C.
Ontvanger:
Verdoven rat met isofluraan (2,5-3%) met behulp van een inductie kamer. Lichaamstemperatuur wordt gehandhaafd tijdens de chirurgische ingreep.
- Scheren buikstreek en gelden oogzalf om de ogen te voorkomen dat het drogen tijdens anesthesie.
- Leg de rat op zijn rug en zet een masker over zijn neus en mond te houden van de anesthesie.
- Ontsmet de buikstreek met behulp van Provo-Jodium, naast het gebruik 80% ethanol, herhaalt u deze stap drie keer.
- Controleer reflexen knijpen de achterpoten voeten om er zeker van dat de rat voldoende anesthesized.
- Voer een middellijn incisie in de buik het scheiden van de huid en de spieren in twee stappen om de buik te openen.
- Plaats de darmen in een verwarmde zoutoplossing gehydrateerd poeder handschoen. Vouw de handschoen rond de darmen om verlies van vocht te voorkomen.
- Verwijder het vetweefsel met betrekking tot de abdominale aorta.
- Ontleden van de aorta van de regio infrarenale formulier naar de vertakking, Pas op dat u schade aan de takken van de schepen te veroorzaken.
- Indien nodig afbinden takken van de aorta.
- Gebruik eerst een microchirurgische klem op de infrarenale deel van de aorta ontleed om de bloedstroom te stoppen.
- Plaats vervolgens een tweede klem dicht bij de bifurcatie van de aorta.
- Nu de bloedstroom is gestopt, moet u een klein segment van de aorta.
- Neem de donor aorta transplantaat, dat is in 0,9% steriele zoutoplossing bewaard op ijs, verkorten tot het voldoende lengte en in de kloof positie.
- Sluit de donor aorta naar de ontvanger aorta, het uitvoeren van lopende hechtingen met 8-0 prolene hechtdraad (Ethicon, Norderstedt, Duitsland). Begin met de schedel end-to-end anastomose.
- Wanneer het distale end-to-end anastomose is voltooid, voorzichtig open de distale klem.
- Wanneer er geen bloeden na het openen van de distale klem, voorzichtig openen van de schedel klem. In het geval van bloeden bij de hechtingen, weer te sluiten van de klem, zoek het bloeden te stoppen en het bloeden met behulp van een enkele steek.
- Er moet een zichtbare impuls aan het distale uiteinde van de aorta te zijn.
- Volgende terug naar de darmen in de buik.
- Spoel de buik met een voorverwarmde steriele zoutoplossing.
- Sluit de spierlaag van de buikwand met 6-0 prolene lopen hechtingen (Ethicon, Norderstedt, Duitsland).
- Gebruik 5-0 prolene (Ethicon, Norderstedt, Duitsland) loopt hechtingen op de huid te sluiten.
- Terwijl de rat is nog steeds in anesthesie, injecteren 4-5mg/kg Carprofen subcutaan.
- Om voldoende analgesie voor dit soort procedure, wordt metamizol toegevoegd aan het drinkwater (50 mg per 100 ml Metamizol) voor pijnstillers voor 3 dagen na de transplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om verschillende redenen vonden we de orthotope aorta transplantatie model een meer nauwkeurige manier om de ontwikkeling van TVP ten opzichte van de heterotope harttransplantatie model te onderzoeken:
Ten aanzien van de chirurgische techniek, de aorta transplantatie model belichaamt een gemakkelijk uitvoerbaar methode, waarbij uitsluitend de verwezenlijking van end-to-end-anastomose, terwijl de heterotope harttransplantatie model kan worden beschouwd als een meer complexe en foutgevoelige uitdaging om de vaardigheden van de chirurg s , die end-to-side anastomose op twee grote bloedvaten.
Analyse en meting van histologische preparaten is drastisch vereenvoudigd, omdat transplantatie vasculopathie kan worden onderzocht in een enkel schip van een enkele bepaalde diameter in plaats van de exploratie van de vele kleine hart-schepen met een grote verscheidenheid in grootte en grondwet die de onderzoeker zou kunnen handicap bij het verkrijgen van objectieve en geloofwaardige resultaten. De thoracale aorta van de ontvanger kan dienen als normale controle, biedt een gemakkelijke en betrouwbare object van vergelijking in diameter en morfologische uiterlijk, terwijl in de heterotope harttransplantatie model is het moeilijk te vergelijken peri-of myocard schepen ten grondslag liggen aan een grote interindividuele variabiliteit.
In aanvulling op deze bevindingen, aorta allografts zijn niet zo gevoelig voor verstorende histologische veranderingen die kunnen voortvloeien uit de toegepaste chirurgische procedures. Fibrose of infarcten kunnen optreden bij en mogelijk ook van invloed zijn heterotope harttransplantatie weefsel en embedded schepen, waardoor ze ongeschikt zijn voor de evaluatie.
Door zijn grootte en de grondwet, de aorta is een ideale onderworpen aan eenvoudige en nauwkeurige onderzoek van morfologische, biochemische en moleculaire remodeling in ieder van de drie lagen van de vaatwand, zoals de mate van concentrische intimale verdikking, myocyte necrose in de media of verhoogde synthese van cytokinen en groeifactoren.
De immuunrespons gegenereerd door een aorta allograft is inderdaad voldoende is om chronisch veranderingen in de transplantatie trigger, maar bleek onvoldoende om acute afstoting (2) induceren. Dankzij deze tussenliggende immunogeniciteit van het transplantaat, is er geen transplantatie verloren van acute afstoting en geen initiële immunosuppressieve behandeling met CsA is vereist. Het model maakt het dus mogelijk om de eerste effecten van drugs op chronische allograft vasculopathie te onderzoeken zonder de invloed of aantasting door profylactische immunosuppressie vaak gezien in heterotope harttransplantaties (2, 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs danken Christiane Pahrmann voor haar histologische werk.
Financiering
Sonja Schrepfer heeft een onderzoekssubsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992 / 3 1 en SCHR992/4-1).]
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical microscope (magnification 25x) | |||
| Isoflurane | |||
| shaver | |||
| Provo-Iodine | |||
| ice cold 0.9% saline | |||
| prewarmed 0.9% sterile saleine | |||
| eye ointment | |||
| glove | |||
| microsurgical scissirs | |||
| forceps | |||
| clamps | |||
| 8-0 suture (prolene) | |||
| 6-0 suture (prolene) | |||
| 5-0 suture (prolene) | |||
| Carprofen | |||
| Metamizol | |||
| Q-tips |
References
- Deuse, T., Hoyt, G., Koyanagi, T., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Prevention and Inhibition But Not Reversion of Chronic Allograft Vasculopathy by FK778. Transplantation. 85, 870-877 (2008).
- Mennander, A., Tiisala, S., Halttunen, J., Yilmaz, S., Paavonen, T., Hayry, P. Chronic rejection in rat allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 11, 671-680 (1991).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 57, 225-225 (1969).
- Poston, R. S., Billingham, M., Hoyt, E. G. Rapamycin reverses chronic graft vascular disease in a novel cardiac allograft model. Circulation. 100, 67-100 (1999).
- Schrepfer, S., Deuse, T., Koch-Nolte, F., Krieger, T., Haddad, M., Schäfer, H., Pelletier, M. P., Robbins, R. C., Reichenspurner, H. FK778 in Experimental Xenotransplantation: A Detailed Analysis of Drug Efficacy. J Heart Lung Transplant. 26, 70-77 (2007).
