Flash Invriezen en Cryosectioning E12.5 hersenen van muizen

Summary

Aangetoond in deze video zijn de technieken voor flash invriezen en snijden embryonale hersenweefsel van de muis. Nuttige tips voor het gebruik van de cryostaat worden gegeven, waaronder het oplossen van problemen methoden die gebruikt kunnen worden tijdens het snijden om ervoor te zorgen dat de resulterende weefsel secties zijn vrij van scheuren en andere vervormingen.

Protocol

1. Fix weefsel in 4% paraformaldehyde in PBS voor de gewenste tijd.
2. Sucrose trekken weefsel (cryoprotection)
   1. Maak 30% sucrose-oplossing in PBS w / v in 2059 buis.
   2. Spoel weefsel 3x in PBS (~ 5 min met schommelen).
   3. Plaats weefsel in 30% sucrose oplossing. Weefsel zal niet zinken.
   4. Plaats het weefsel in 4 ° C 's nachts, of totdat het is gezonken.
3. Label juiste grootte cryomold met informatie en oriëntatie.
4. Vul cryomold met oktober (vermijd luchtbellen).
5. Overdracht weefsel oktober bad en coaten met oktober
6. Overdracht weefsel LGO cryomold.
7. Orient het weefsel onder de microscoop.
8. Giet vloeibaar stikstof in plastic petrischaal.
9. Snel en zorgvuldig lager het weefsel in cryomold in de stikstof. (Niet onderdompelen de top van de cryomold.)
10. Wanneer de LGO solide is wit, plaats de bevroren weefsel in -80 ° C vriezer voor de opslag.
11. Evenwicht weefsel tot ~ 20 ° C gedurende ten minste 30 minuten. voorafgaand aan snijden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue-Tek Cryomold	Ted Pella, Inc.	27181
O.C.T.	Ted Pella, Inc.	27050
Sucrose solution			30% sucrose solution in PBS w/v
paraformaldehyde			4% paraformaldehyde in PBS