Summary
Dimostrato in questo video sono le tecniche per flash congelamento e sezionamento del tessuto embrionale del cervello di topo. Consigli utili per l'utilizzo del criostato sono dati, compresi i metodi di risoluzione dei problemi che possono essere utilizzati durante il taglio per assicurare che le sezioni risultanti tessuti sono privi di crepe e altre distorsioni.
Protocol
- Fissare il tessuto in paraformaldeide 4% in PBS per il tempo desiderato.
- Saccarosio infondere tessuto (crioprotezione)
- Preparare la soluzione di saccarosio al 30% in PBS w / v nel 2059 tubo.
- Lavare il tessuto in PBS 3x (~ 5 min con dondolo).
- Tessuto posto in soluzione di saccarosio al 30%. Tessuto non affonderà.
- Posizionare il tessuto in 4 ° C durante la notte, o fino a quando è affondata.
- Dimensione etichetta appropriata cryomold con informazioni e orientamento.
- Riempire cryomold con OCT (evitare bolle).
- Trasferimento di tessuto a bagno ottobre e il cappotto con ottobre
- Trasferimento di tessuto da ottobre a cryomold.
- Orientare il tessuto al microscopio.
- Versare l'azoto liquido in plastica piastra di Petri.
- Rapidamente e con attenzione abbassare il tessuto cryomold in azoto. (Non immergere la parte superiore del cryomold.)
- Quando l'OCT è solido bianco, posto il tessuto congelato nel freezer -80 ° C per la conservazione.
- Equilibrare tessuto a ~ 20 ° C per almeno 30 min. prima di sezionamento.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue-Tek Cryomold | Ted Pella, Inc. | 27181 | |
O.C.T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
Sucrose solution | 30% sucrose solution in PBS w/v | ||
paraformaldehyde | 4% paraformaldehyde in PBS |