Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

doi: 10.3791/1991 Published: July 1, 2010

Summary

في هذا الفيديو نظهر الكهربائي كفاءة الخلايا

Abstract

الكهربائي الخلية هو طريقة آمنة وغير الفيروسية وغير الكيميائية التي يمكن استخدامها لتحضير الخلايا الهجينة لعلاج البشر. الكهربائي ينطوي على تطبيق نبضات قصيرة عالية الجهد الكهربائي للخلايا التي هي على اتصال وثيق. تطبيق قصيرة ، والبقول الكهربائية ذات الجهد العالي يسبب زعزعة الاستقرار في أغشية الخلايا البلازمية. الأغشية زعزعة الاستقرار أكثر نفاذا لجزيئات مختلفة ، وعرضة أيضا للاندماج مع أي الأغشية المجاورة زعزعة الاستقرار. الكهربائي وبالتالي وسيلة مريحة لتحقيق الانصهار غير محددة من خلايا مختلفة جدا

Protocol

أولا تحميل الخلايا مع الخلايا بتتبع CMFDA وCMRA

  1. وقد أجريت تجارب على خلايا سرطان الجلد معدة مسبقا من الماوس خط الخلية (B16 - F1). تزرع الخلايا في اثنين من فصل القوارير 25 سم ثقافة 2 (TPP ، ZDA) لالتقاء 70-80 ٪ في المتوسط ​​الثقافة DMEM (وسط Dulbecco لتعديل النسر) تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ ، 0.15 ملغ / مل L - الجلوتامين ، 16 ملغ / مل جنتاميسين (جميع من سيغما الدريخ ، ألمانيا) ، 200 وحدة / مل crystacillin (شركة بليفا ، كرواتيا) ، وحضنت في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية.
  2. إعداد two الأسهم 10 ملم حلول تعقب الخلية (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) وذلك بإضافة 10.76 ميكرولتر و 9 ميكرولتر (على الأخضر والبرتقالي CMFDA CMRA ، على التوالي) من DMSO (سيغما الدريخ ، ألمانيا) إلى 50 ميكروغرام من الصبغة في النص الأصلي Invitrogen القارورة. ويمكن تخزين محلول المخزون في ثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة بضعة أشهر. قبل البدء في التجارب ، والاحماء الحل حتى تذوب بلورات DMSO.
  3. تعد خالية من بيكربونات كريبس - Hepes العازلة (130 مم كلوريد الصوديوم و 4.7 ملي بوكل ، 1.2 ملي MgSO 4 ، 1.2 ملم KH 2 PO 4 ، 11.7 ملي D - غلوكوز ، 1.3 ملي CaCl 2 ، 10 HEPES ملي ، ودرجة الحموضة 7.4). في اثنين من 15 مل إيبندورف أنابيب منفصل مزيج 2.1 ميكرولتر من كل حل سهم (10 ملم أو CMFDA CMRA ، على التوالي) في 3 مل من العازلة كريبس - Hepes بيكربونات خالية. هذه الغلة "حل تحميل" التي تحتوي على ما يقرب من 7 CMFDA ميكرومتر (أو CMRA).
  4. شطف الخلايا مرتين مع العازلة كريبس - Hepes بيكربونات خالية من ثم إدراج وتحميل حلول في قوارير. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. خلال هذه الكواشف حضانة first يمر بحرية من خلال أغشية الخلايا ، ولكن مرة واحدة داخل الخلية ، وتحولت إلى خلية الكواشف impermeant منتجات التفاعل الفلورسنت.
  5. بعد مرور فترة الحضانة الأولى ، واحتضان شطف الخلايا مع مستنبت لمدة ساعتين في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية.
  6. يعرض للتريبسين الخلايا في كل من قوارير (محملة CMFDA وCMRA) ومزيج خلايا الدم الحمراء والخضراء معا في نسبة 1:1 في أنبوب الطرد المركزي 50 مل (TPP ، ZDA). ضبط تركيز الخلية إلى الخلايا 5 × 6 / 10 مل من قبل مع تخفيف DMEM المتوسطة أو مع تركيز أجهزة الطرد المركزي. مكان انخفاضا بنسبة 20 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من لوحة multiwell 24 (TPP ، ZDA). احتضان خلايا في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للسماح لهم نعلق قليلا على سطح البئر وإقامة اتصالات الخلية.

II. الكهربائي

  1. إعداد isoosomolar العازلة فوسفات البوتاسيوم (10 ملم KH2PO4 ، 10 ك 2 ملي هبو 4 ، 1MM MgCl 2 ، 250 ملي السكروز) وhypoosmolar العازلة فوسفات البوتاسيوم (10 ملم KH2PO4 ، 10 ك 2 ملي هبو 4 ، 1MM MgCl 2 ، 75 ملي السكروز) .
  2. ضع multiwell مع الخلايا على موقف المجهر ، مرحلة الأقطاب في قاع البئر وربطها مولد النبض.
  3. غسل الخلايا مع 1 مل من isoosomolar العازلة الفوسفات البوتاسيوم. إضافة 350 ميكرولتر من hypoosmolar العازلة الفوسفات البوتاسيوم من أجل حمل تورم الخلية. ينبغي أن تغطي العازلة الأقطاب.
  4. ترك الخلايا في hypoosmolar العازلة لمدة 2 دقيقة قبل تطبيق نبضات كهربائية. خلال هذا الوقت من تدفق جزيئات الماء في الخلايا نتيجة لاختلال التوازن التناضحي بين الداخل والخارج من الخلايا يسبب زيادة حجم الخلية. ينبغي أن تطبق النبضات الكهربائية عند الخلايا هي قريبة من أحجامها القصوى ، وذلك قبل بدء انخفاض حجم التنظيمية.
  5. لتحقيق الكهربائي الأمثل والحفاظ على سلامة الخلية ، يجب استخدام المعلمات الأمثل للنبضات الكهربائية. هذه تعتمد على خط الخلية المستخدمة [1]. في هذه التجربة يتم تطبيقها قطار من 8 البقول مستطيلة (مع كل مدة من 100 ميكرو ثانية في 1 هرتز) لكل عينة ، وذلك باستخدام جهاز electroporation (Cliniporator في حالتنا ، IGEA ، إيطاليا). يتم تسليم لنبضات كهربائية متوازيين سلك حزب العمال / عير بقطر 0.8 ملم و 5 ملم المسافة بينهما ، وتهيئة المجال الكهربائي لحوالي 1200 V / سم بين الأقطاب في كل بئر ، باستثناء عنصر التحكم بشكل جيد.
  6. ترك الخلايا دون عائق لمدة 10 دقيقة بعد الولادة النبض. تحديد العائد الانصهار عن طريق الفحص المجهري النقيض الفلورسنت والمرحلة.

III. الحصول على الصور وتحديد العائد الانصهار

  1. ويلاحظ في الخلايا باستخدام المجهر مضان (في حالة لدينا زايس AxioVert 200 ، زايس ، ألمانيا) مجهزة هدفا (X20) وكاميرا CCD تبريد (VisiCam 1280 ، Visitron ، ألمانيا). يتم الحصول على الصور في MetaMorph 7.1.1 (الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ولكن يمكن أيضا استخدام برامج أخرى مشابهة يمكن اكتساب. هو متحمس CMFDA مع مستوحد اللون (فازة الرابع ، Visitron والمانيا) في 492 نانومتر و 548 نانومتر في CMRA. ويتم الحصول على ومضان من CMFDA CMRA باستخدام مرشحات الانبعاثات ، أحدهما يركز على نانومتر 535 (HQ535/30m ، لCMFDA) وتركز الأخرى على 510 نانومتر (D605/55m ، لCMRA ، سواء كروما ، الولايات المتحدة). منعت استخدام مزدوج اللون المرآة (Q515LP) الحديث عبر القناة.
  2. الحصول على ثلاث صور (المرحلة النقيض والأحمر والأخضر ومضان) لمدة خمسة حقول اختيارها عشوائيا في كل بئر. إنشاء صور ثلاثة من كل قناة الثلاثي الصورة. ويمكن في مثل هذه الصورة أن ينظر إلى السيتوبلازم الاستشعاع مع أغشية الخلايا. وبالتالي يمكن أن تنصهر فيها خلايا تحدد بسهولة [الشكل 1].
  3. عد كافة الأنواع الثلاثة من الخلايا (الأحمر والأخضر والفلورسنت مزدوج) في كل صورة القناة الثلاث. تحديد نسبة الخلايا الفلورسنت مزدوج بقسمة عدد الخلايا الفلورسنت بشكل مزدوج مع عدد من كافة الخلايا في كل صورة. يتم تعريف العائد الانصهار كنسبة مئوية من الخلايا الفلورسنت مزدوج مضروبا منذ 2 لم يتم الكشف عن نصف الخلايا تنصهر (عندما خلايا فتيل نفس اللون).

ممثل النتائج

الشكل 1
الشكل 1 ثلاثة صورة مجهرية قناة B16F1 الخلايا بعد الكهربائي : المرحلة المقابل ، CMRA مضان (الإثارة في 548 نانومتر) وCMFDA مضان (الإثارة في 492 نانومتر) ، التكبير الهدف 20X

Discussion

قدرة على المزج بين أغشية الخلايا غير محدد ، على سبيل المثال ، من خلال الحقول الكهربائية الخارجية ، والمهم في الطب ، والتكنولوجيا الحيوية والبحوث في علم الأحياء. الانصهار غير محدد من هذا القبيل تتيح انتاج الخلايا الهجينة ذات قيمة عالية ومنتجاتها ، مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، ويوفر معلومات حول الآليات الأساسية [2] الانصهار. الكهربائي هو طريقة فعالة للغاية نظرا لاحتمال أنه يمكن تعديلها بشكل صحيح إلى أنواع مختلفة من الخلايا. ويتحقق الكهربائي عندما يتم إحضارها الخلايا في اتصال جسدي وثيق في دولتهم fusogenic (عرضة للانصهار) عن طريق الضغط العالي نبضات كهربائية. كفاءة الكهربائي يعتمد على مختلف المعايير التي تؤثر على جزأين من عملية الكهربائي. الجزء الأول من عملية الكهربائي هو تحقيق الاتصال الجسدي الوثيق بين الخلايا ، ويمكن الحصول عليها بطرق مختلفة [3-8]. ويمكن استخدام أسلوب الالتزام (الخلايا المتنامية لالتقاء) نظرا لكفاءة الاتصالات الخلية أنشئت عفويا في مناطق واسعة بين الخلايا ، إلا أنها تنتج خلايا كبيرة جدا تنصهر مع العديد من النوى. نحن نستخدم طريقة التقيد تعديل ، حيث يتم الحصول على الخلايا الصغيرة (مع النوى 2-5) ، والتي هي أكثر عرضة للبقاء على قيد الحياة وتتكاثر ، (الشكل 1). الاتصال بين الخلايا تستفيد أيضا من تورم التناضحي من الخلايا ، وذلك بسبب المعاملة التناضحي التي استخدمت في التجربة [9]. الجزء الثاني من عملية الكهربائي هو تحقيق الدولة fusogenic للأغشية الخلية. الدولة Fusogenic يرتبط بشكل جيد مع دولة electropermeabilized الغشاء (خلايا غير قابلة للتحديدا permeabilized إلى الجزيئات التي عادة لا يمكن ان تمر من خلال الغشاء سليمة) ، وتحكمها نفس المعلمات من نبضات كهربائية (السعة ، وطولها ، وعدد وتردد) [10] . قيم المعلمات الكهربائية اللازمة لelectroporation الأمثل [1] ، وتختلف الكهربائي بين الخلايا المختلفة ، وتعتمد على حجم الخلايا وخصائصها البيولوجية. معلمات الكهربائية وبالتالي الحاجة إلى أن يكون الأمثل لخطوط مختلفة من الخلايا ، والتي تستخدم كشركاء الانصهار ، للحصول على الانصهار.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل وكالة أبحاث السلوفينية (J2 - 9764 مشروع وبرنامج P2 - 0249). هذا الفيديو يمثل المواد التكميلية عن "تقنيات Electroporation القاعدة والعلاج" ورشة عمل علمية ودورة الدراسات العليا ، الذي نظمته كلية الهندسة الكهربائية في جامعة ليوبليانا ، سلوفينيا.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
CMRA Reagent Invitrogen C34551 Cytosolic fluorescent dye
CMFDA Reagent Invitrogen C7025 Cytosolic fluorescent dye
DMSO Reagent Sigma-Aldrich D2650
DMEM Reagent Sigma-Aldrich D5671 Dulbecco’s modified Eagle’s medium
Fetal calf serum Reagent Sigma-Aldrich F4135
L-glutamine Reagent Sigma-Aldrich G7513
crystacillin Reagent Pliva 625110 antibiotic
gentamicin Reagent Sigma-Aldrich G1397 antibiotic
Hepes Reagent Sigma-Aldrich H0887
KH2PO4 Reagent Merck & Co., Inc. A124873 927
KH2PO4 Reagent Sigma-Aldrich 4248
MgCl2 Reagent Sigma-Aldrich M-8266
NaCl Reagent Fluka 71382
KCl Reagent Merck & Co., Inc. A154336 908
MgSO4 Reagent Sigma-Aldrich M2643
D-glucose Reagent Sigma-Aldrich G8270
CaCl2 Reagent Sigma-Aldrich C4901
sucrose Reagent Sigma-Aldrich 16104
Electric pulse generator Tool IGEA Cliniporator VITAE
Multiwell plate Tool Techno Plastic Products 92424
50 ml centrifuge tube Tool Techno Plastic Products 91050
15 ml centrifuge tube Tool Techno Plastic Products 91015
25 cm2 culture flask Tool Techno Plastic Products 90026
Electrodes Tool Custom Made Pt/Ir

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro. Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).
  2. Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells. Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).
  3. Rols, M. -P., Teissié, J. Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure. Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).
  4. Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. Methods in Enzymology. 220, 174-196 Forthcoming.
  5. Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions. Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).
  6. Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. Mechanically facilitated cell-cell electrofusion. Biophys J. 67, (4), 1574-1581 (1994).
  7. Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. Cell hybridization by electrofusion on filters. Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).
  8. Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip. Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).
  9. Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization. Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).
  10. Teissié, J., Ramos, C. Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes. Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).
متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trontelj, K., Ušaj, M., Miklavčič, D. Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (41), e1991, doi:10.3791/1991 (2010).More

Trontelj, K., Ušaj, M., Miklavčič, D. Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (41), e1991, doi:10.3791/1991 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter