Summary
בסרטון הזה אנחנו מדגימים electrofusion יעילה של תאים
Abstract
Electrofusion Cell היא שיטה בטוחה, לא ויראלי ולא כימי שיכול לשמש להכנת תאים היברידית לטיפול אנושי. Electrofusion כולל יישום של מתח גבוה בפולסים קצרים חשמליים לתאים הנמצאים במגע קרוב. יישום קצר, מתח גבוה פולסים חשמליים גורם היציבות של ממברנות פלזמה התא. ממברנות ערער הם חדירים יותר עבור מולקולות שונות ונוטים גם איחוי הקרומים ערער עם כל השכנים. Electrofusion הוא אפוא דרך נוחה להשיג היתוך הלא ספציפית של תאים שונים מאוד
Protocol
אני טוען את התאים עוקבים Cell CMFDA ו CMRA
- ניסויים שבוצעו על תאים שהוכנו בעבר שורה של מלנומה תא העכבר (B16-F1). התאים גדלים בשני מופרדות 25 ס"מ 2 צלוחיות תרבות (TPP, ZDA) כדי מפגש 70-80% במדיום תרבות DMEM (מדיום שונה Dulbecco של הנשרים) בתוספת סרום 10% שור עוברית, 0.15 מ"ג / מ"ל L-גלוטמין, 16 מ"ג / ml גנטמיצין (כולם סיגמא אולדריץ, גרמניה), 200 יחידות / מ"ל crystacillin (Pliva, קרואטיה), ו מודגרות ב 5% CO 2 ב 37 ° C.
- להכין שתי מניות 10 mM פתרונות של עוקבים Cell (Invitrogen, ארה"ב) על ידי הוספת 10.76 μl ו 9 μl (עבור גרין CMFDA עבור אורנג' CMRA, בהתאמה) של DMSO (סיגמא אולדריץ, גרמניה) עד 50 מיקרוגרם של צבע במקור Invitrogen בקבוקון. הפתרון המניה ניתן לאחסן במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. לפני שמתחילים את הניסויים, לחמם את הפתרון עד גבישים של DMSO להתמוסס.
- הכן ביקרבונט ללא קרבס-Hepes חיץ (130 mM NaCl, KCl mM 4.7, 1.2 mM MgSO 4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 11.7 מ"מ D-גלוקוז, 1.3 mM CaCl 2, 10 HEPES מ"מ, pH 7.4). בשני 15 מ"ל Eppendorf צינורות בנפרד לערבב 2.1 μl של כל פתרון המניות (10 mM CMFDA או CMRA, בהתאמה) מ"ל 3 של חיץ קרבס-Hepes ביקרבונט חינם. זה מניב "פתרון טעינת" המכיל כ 7 מיקרומטר CMFDA (או CMRA).
- יש לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ קרבס-Hepes ביקרבונט חינם ולאחר מכן הכנס טעינת פתרונות לתוך צלוחיות. דגירה התאים במשך 30 דקות ב 5% CO 2 ב 37 ° C. במהלך זה ריאגנטים הדגירה first לעבור בחופשיות דרך קרום התא, אבל פעם בתוך התא, ריאגנטים הופכים תאים impermeant תוצרי התגובה ניאון.
- לאחר דגירה ראשונה, לשטוף דגירה תאים בינוניים עם תרבות לעוד שעתיים 5% CO 2 ב 37 ° C.
- Trypsinize תאים צלוחיות שניהם (עמוסה CMFDA ו CMRA) ומערבבים תאים אדום וירוק יחד יחס 01:01 בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל (TPP, ZDA). התאם את הריכוז התא 5 x 10 6 תאים / מ"ל ידי דילול עם המדיום DMEM או על ידי ריכוז עם צנטריפוגות. מניחים ירידה של 20 μl ההשעיה תא היטב כל אחד 24 multiwell צלחת (TPP, ZDA). דגירה תאים 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לאפשר להם מעט לצרף אל פני השטח של הבאר קשרים התא.
השנייה. Electrofusion
- הכן חיץ isoosomolar פוספט אשלגן (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, סוכרוז 250 מ"מ) פוספט hypoosmolar חיץ אשלגן (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, סוכרוז 75 mM) .
- מניחים את multiwell עם תאים על העמדה הבמה, המיקרוסקופ אלקטרודות בתחתית הבאר לחבר אותם מחולל את הדופק.
- לשטוף את התאים מ"ל 1 של חיץ isoosomolar פוספט אשלגן. הוסף 350 μl של חיץ hypoosmolar פוספט אשלגן על מנת לגרום לנפיחות התא. המאגר אמור לכסות את האלקטרודות.
- השאירו תאים חיץ hypoosmolar 2 דקות לפני החלת פולסים חשמליים. במהלך הזמן הזה זרם של מולקולות המים לתוך התאים בשל חוסר איזון אוסמוטי בין הפנים לבין החוץ של התאים לגרום לעלייה של נפח התא. פולסים חשמליים צריך להיות מיושם כאשר תאים קרובים כרכים המקסימלי שלהם, לפני תחילת הירידה בהיקף הרגולציה.
- כדי להשיג electrofusion האופטימלי ולשמור על כדאיות התא, פרמטרים אופטימליים של פולסים חשמליים אמור לשמש. אלה תלויות שורת תאים המשמשים [1]. בניסוי זה רכבת של 8 פולסים מלבני (כל אחד עם משך 100 μs בבית הרץ 1) מוחל על כל דגימה באמצעות מכשיר electroporation (ב Cliniporator במקרה שלנו, איג'יאה, איטליה). פולסים מועברים לשני Pt / עיר אלקטרודות מקבילות חוט בקוטר 0.8 מ"מ ו - 5 מ"מ המרחק ביניהם, יצירת שדה חשמלי של כ 1200 V / ס"מ בין האלקטרודות בכל טוב, למעט לשלוט היטב.
- השאר את התאים ללא הפרעה במשך 10 דקות לאחר הלידה הדופק. קבע את התשואה היתוך באמצעות מיקרוסקופ לעומת הניאון שלב.
ג. תמונה הרכישה קביעת התשואה היתוך
- התאים הם נצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במקרה שלנו Zeiss AxioVert 200, Zeiss, גרמניה) מצויד אובייקטיבי (X20) ומצלמה מקורר CCD (VisiCam 1280, Visitron, גרמניה). התמונות הן רכשה MetaMorph 7.1.1 (התקנים מולקולריים, ארה"ב), אך רכישת תוכנה דומה אחרת יכול לשמש גם. CMFDA מתרגש עם monochromator (צבעוני IV, Visitron, גרמניה) ב 492 ננומטר CMRA ב 548 ננומטר. הקרינה של CMFDA ו CMRA נרכש באמצעות שני מסנני פליטה, אחד מרוכז ב 535 ננומטר (HQ535/30m, עבור CMFDA) ואת מרוכז אחרים 510 ננומטר (D605/55m, עבור CMRA, הן Chroma, ארה"ב). השימוש dichroic במראה (Q515LP) מנעו לדבר לעבור ערוץ.
- רוכשת שלוש תמונות (לעומת שלב, אדום וירוק פלואורסצנטי) במשך חמישה שדות שנבחרו באקראי היטב כל אחד. יצירת ערוץ שלוש תמונות מתוך שלישיה כל התמונה. בתמונה כגון הציטופלסמה fluorescing ניתן לראות יחד עם קרום התא. התאים התמזגו ולכן יכול להיקבע בקלות [תמונה 1].
- ספירת כל שלושת סוגי התאים (אדום, ירוק ניאון dually) בתוך תמונה תלת כל ערוץ. לקבוע את אחוז התאים פלורסנט dually על ידי חלוקת מספר התאים פלורסנט dually עם מספר תאים כל אחת מהתמונות. תשואה Fusion מוגדר כאחוז של תאים פלורסנט dually כפול 2 מאז מחצית התאים התמזגו לא מזוהים (כאשר תאים של הפתיל באותו צבע).
נציג תוצאות
איור 1 שלושה מיקרוסקופיה ערוץ תמונה של B16F1 תאים לאחר electrofusion:. בניגוד שלב, CMRA פלואורסצנטי (עירור ב 548 ננומטר) CMFDA פלואורסצנטי (עירור ב 492 ננומטר), הגדלה 20x אובייקטיבי
Discussion
היכולת של קרום התא אל הפתיל הלא ספציפית, למשל, על ידי שדות חשמליים חיצוניים, חשוב הרפואה והביוטכנולוגיה, מחקר בביולוגיה. היתוך ספציפי כזה מאפשר ייצור של תאים היברידית יקר מאוד את המוצרים שלהם, כגון נוגדנים חד שבטיים, מספק מידע על המנגנונים הבסיסיים של היתוך [2]. Electrofusion היא שיטה פוטנציאלי יעיל מאוד שכן הוא יכול להיות מותאם כראוי לסוגים שונים של תאים. Electrofusion מושגת כאשר תאים מגע פיזי קרוב מובאים למצב fusogenic שלהם (מועדים היתוך) באמצעות מתח גבוה פולסים חשמליים. את היעילות של electrofusion תלוי פרמטרים שונים המשפיעים על שני חלקים של תהליך electrofusion. חלק ראשון של תהליך electrofusion הוא הישג של מגע פיזי קרוב בין התאים, אשר ניתן להשיג עם שיטות שונות [3-8]. שיטה דבקות (תאים גוברת מפגש) יכול להיות מנוצל ביעילות בשל הקשר תא הוקמה באופן ספונטני באזורי גדול בין תאים, אך היא מייצרת תאים התמזגו גדול מאוד עם גרעינים רבים. אנו בשיטת דבקות שונה, שבו תאים קטנים (עם הגרעינים 2-5), אשר יש סיכוי גבוה יותר לשרוד להתרבות, מתקבלים (איור 1). קשר בין תאים גם ליהנות נפיחות האוסמוטי של תאים, עקב טיפול אוסמוטי השתמשו בניסוי [9]. החלק השני של התהליך electrofusion הוא הישג של מדינת fusogenic של קרום התא. המדינה Fusogenic וקושרת היטב עם המדינה electropermeabilized של הממברנה (תאים שאינם דווקא permeabilized מולקולות שבדרך כלל לא יכול לעבור דרך הממברנה ללא פגע), והוא נשלט על ידי הפרמטרים זהה של פולסים חשמליים (אמפליטודה, אורך מספר ותדירות) [10] . הערכים של הפרמטרים החשמליים הדרושים electroporation אופטימלי [1] electrofusion שונים בין תאים שונים, תלוי בגודל תאים התכונות הביולוגיות שלהם. פרמטרים חשמל וכך צריך להיות מותאם עבור שורות תאים שונים, אשר משמשים כשותפים היתוך, כדי להשיג היתוך.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות למחקר סלובנית (פרויקט J2-9764 תוכנית P2-0249). וידאו זה מהווה חומר משלים עבור "electroporation מבוססי טכנולוגיות וטיפולים" סדנה מדעית קורס אקדמי, המאורגן על ידי הפקולטה להנדסת חשמל באוניברסיטת ליובליאנה, סלובניה.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CMRA | Reagent | Invitrogen | C34551 | Cytosolic fluorescent dye |
| CMFDA | Reagent | Invitrogen | C7025 | Cytosolic fluorescent dye |
| DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM | Reagent | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s modified Eagle’s medium |
| Fetal calf serum | Reagent | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Reagent | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Hepes | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| KH2PO4 | Reagent | Merck & Co., Inc. | A124873 927 | |
| KH2PO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | 4248 | |
| MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaCl | Reagent | Fluka | 71382 | |
| KCl | Reagent | Merck & Co., Inc. | A154336 908 | |
| MgSO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| D-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| sucrose | Reagent | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| Electric pulse generator | Tool | IGEA | Cliniporator VITAE | |
| Multiwell plate | Tool | Techno Plastic Products | 92424 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tool | Techno Plastic Products | 91050 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 25 cm2 culture flask | Tool | Techno Plastic Products | 90026 | |
| Electrodes | Tool | Custom Made | Pt/Ir |
References
- Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro. Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).
- Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells. Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).
- Rols, M. -P., Teissié, J. Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure. Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).
- Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. Methods in Enzymology. 220, 174-196 Forthcoming.
- Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions. Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).
- Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. Mechanically facilitated cell-cell electrofusion. Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).
- Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. Cell hybridization by electrofusion on filters. Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).
- Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip. Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).
- Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization. Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).
- Teissié, J., Ramos, C. Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes. Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).
