Techniques d'imagerie Ca ^{2 +} Signalisation dans le sperme humain

Summary

Stimulation évoqués [Ca

Abstract

La microscopie à fluorescence des cellules chargées avec fluorescentes, Ca

Protocol

Spermatozoïdes de mâles fertiles saine, avec une analyse de sperme normal, sont normalement préparés pour l'imagerie comme suit.

1. Des échantillons de sperme sont stockés à 37 ° C pendant plus de 30 min. Les cellules sont isolées du plasma séminal par nager jusqu'à en solution de Earle sel complété équilibré (SEBS; mM: 1,8 CaCl ₂ .2 H ₂ O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 26,2 NaHCO _3, 1,0 NaH ₂ PO _4. 2H ₂ O, 116,4 NaCl, 55,6 D-glucose, 2,73 Na pyruvate, le lactate de Na 41,8) complémenté avec 0,3% d'acide charbon de-lipidated/fatty gratuitement Fraction V BSA (qualité de la BSA est crucial pour réussir capacitation du sperme). 1 ml de sEBBS est pipeté dans chaque d'une série de tubes de 5 ml et doucement underlayered avec 0,3 ml de sperme. Après une incubation de 1 heure (37 ° C, 6% de CO ₂₎ au sommet de 0,7 ml est doucement retiré de chaque tube et mis en commun. 10 ul de la suspension du sperme est dilué avec 90 ul de 1% (v / v) de formol pour immobiliser les cellules, puis de sperme sont comptées dans une chambre de Neubauer. La densité des cellules dans la suspension est ensuite ajusté (avec SEBS) à 6 millions de cellules / ml.
2. L'échantillon est ensuite divisé en aliquotes de 200 pl dans des tubes faiblement recouvertes et incubées (37 ° C, 6% de CO ₂₎ dans pour les 5-6 h pour permettre capacitation.
3. Lamelles (22x50 mm) ont été préalablement traités avec de la poly-D-lysine. 10 pl de poly-D-lysine solution (10% p / v) est appliqué comme un certain nombre de petites gouttes vers le centre de la lamelle. Le poly-D-lysine est ensuite sécher à l'air. Cela peut être sur une scène chauffée et devrait être de compléter la sécheresse. Une lamelle est attaché avec de la graisse à vide pour un espace clos, construite à cet effet, pleins, chambre de polycarbonate imagerie (dimensions 35 mm x 20 mm x 5 mm, capacité ≈ 180 pl.) Similaire à la chambre Warner RC20 La poly-D-lysine lamelle revêtement constitue la base de la chambre lorsque les cellules sont visualisés sur un microscope inversé et une circulaire de 12 mm de diamètre lamelle forme la surface supérieure de la chambre, ce qui permet la transmission de la lumière.
4. Oregon Green BAPTA1-AM (OGB) ou de calcium vert 1-AM sont utilisés pour les cellules de l'étiquetage. OGB est préparé par dissolution dans le DMSO. Pluronic F127 acide (un détergent) est inclus dans le DMSO pour empêcher «l'agglutination» de la teinture. Ceci peut être préparé en laboratoire (100 Pluronic mg dans 0,5 ml de DMSO), immédiatement avant l'utilisation, ou peuvent être achetés pré-préparés. 20 ul est ajouté à une aliquote de 50 mg de l'OGB (2,5 mg / ml). Le flacon peut être conservé congelé et décongelé pour utilisation ultérieure.
5. Après capacitation du sperme (5-6 h en sEBBS, 37 ° C; 6% de CO ₂₎ d'un tube est sélectionné pour l'imagerie et de 1,2 pi de solution de OGB est ajouté, donnant une concentration finale de 10 pM. Le tube est ensuite incubée pendant encore de 40 minutes, après quoi la suspension cellulaire est doucement injecté dans le port d'entrée de la chambre de l'imagerie avec un P1000 (bleu) pointe de la pipette. La chambre est placée dans le côté lamelle incubateur, la poly-D-lysine vers le bas, pendant 20 min. Les cellules ont tendance à nager le long des surfaces de la chambre et va adhérer à la zone de la poly-D-lysine.
6. La chambre est maintenant montée sur le microscope, relié à l'appareil de perfusion et perfusé à environ 0,5 ml / min. Une pompe à rouleaux nourrit une solution saline dans la chambre et le débordement de l'orifice de sortie est éliminé par une pompe d'aspiration avec piège. La préparation est laissé dans l'obscurité pendant au moins 10 min, tout en vrac et les cellules de colorant extracellulaire sont enlevés par une perfusion de la chambre. Stabilité de la température est extrêmement important parce que de petites fluctuations peuvent non seulement affecter la cellule de Ca ^{2 +} homéostasie, mais peut également affecter _Kd de la teinture. Des expériences sont normalement effectuées à 25 ° C, obtenue en maintenant la température de la pièce sombre à ce niveau. Nous avons trouvé que le maintien de la température ambiante au niveau requis fournit une plus grande stabilité en température et se concentrer que d'utiliser une phase à température contrôlée ou d'un chauffage thermostaté sur l'afflux saline.
7. Les cellules sont considérées sous contraste de phase (40x 60x ou immersion dans l'huile) objective et une zone pour l'imagerie est sélectionné. La portion de la zone de poly-D-lysine enduit qui est près du port d'entrée est préférable, lorsque le flux est laminaire salée et cohérente. Il est également important d'utiliser une zone où la densité des cellules est appropriée (densité excessive affecte la qualité et l'intégrité des données grâce ramassage du signal à partir des cellules adjacentes) et où les cellules sont suffisamment attachés, mais l'activité est perceptible flagellaire. Une image en contraste de phase est sauvé. Le microscope est alors commuté en mode de fluorescence (excitation 480 nm; émission de 540 nm) et temps d'exposition est réduite au minimum nécessaire pour obtenir une image claire de fluorescence (généralement de 50 à 200 ms).
8. L'expérience est lancée en activant le logiciel de séries temporelles d'acquisition d'image (IQ). Généralement les images sont acquises à raison de 0,1 Hz et d'éclairage est limité à des périodes d'acquisition des images en utilisant uniquement une logire d'obturation contrôlée. Beaucoup des taux plus élevés d'acquisition des images peut être utilisé mais il faut tenir compte des problèmes de blanchiment et de la production d'artefacts dus à la photo-dommages aux cellules (voir la discussion). QI (et la plupart des autres plates-formes de logiciels d'acquisition) permettra en temps réel graphique de la fluorescence lors de l'expérience.
9. Après une période de contrôle de 3-5 minutes la durée de manipulation des constituants salins (comme [Ca ^{2 +]} _o) et l'application de médicaments est réalisée par le remplacement d'une solution saline dans l'entête de la perfusion. Moment de l'addition de chaque stimulus est noté afin que le temps d'arrivée dans la chambre de l'imagerie peut être calculée, offrant une précision suffisante pour l'évaluation des réponses lentes décrit ici (échantillonnés à 0,1 Hz). Pour des réponses plus rapides plus grande précision peut être obtenue en ajoutant des stimuli directement au flux salin à travers un port afflux secondes comme prévu dans la chambre de Warner RC20.
10. Les images sont analysées hors ligne en utilisant le QI. Régions d'intérêt (ROI) sont dessinés autour de chaque cellule (ou une partie de la cellule) et aussi une zone de cellules libres est sélectionné (pour soustraction de fond automatique par le logiciel. La série d'images est ensuite vérifiée pour enlever les cellules qui sont morts ou ont subi la réaction acrosomique ( qui apparaît comme une augmentation importante et rapide de la fluorescence suivie par la perte de colorant cytoplasmique) pendant l'expérience et ceux qui ont montré un mouvement suffisant pour causer des artefacts lors analysés comme une série chronologique.
11. Une série d'intensité de fluorescence du temps est alors obtenue pour chaque ROI et ces données sont analysées hors ligne dans Excel. Initialement fluorescence est normalisée à la valeur moyenne obtenue durant la période de contrôle, en utilisant l'équation R = _[(reste FF) / F _repos] x 100%, où R est le changement de la fluorescence% par rapport à la période de contrôle, F est l'intensité de fluorescence à un instant t et de _repos F est la moyenne d'au moins 30 déterminations de F obtenue durant la période de contrôle.

Les résultats représentatifs

La figure 1 montre une série d'images à partir d'une expérience dans laquelle les cellules ont été stimulées avec 3 progestérone uM. La rangée supérieure et le film 1 montrent les images de fluorescence en échelle de gris et les mages mêmes sont présentés ci-dessous (et dans le film 2) en pseudo (lookup '16_colors table »dans l'image J), ​​où« cool »couleurs indiquent une faible intensité fluorescente et «chaudes» couleurs indiquent haute intensité de fluorescence. Les cellules peuvent être consultés dans les pseudo-cours de l'expérience, en utilisant les tables de recherche dans le QI, mais en utilisant une échelle de gris est généralement plus informative pour évaluer. Si les cellules sont bien étiquetés. Les deux premières images ont été recueillies à 0 s et 100 s après le début de l'enregistrement. Fluorescence doit être stable et tend à être plus forte dans l'espace post acrosomique des spermatozoïdes et le cou. La progestérone est entré dans la chambre d'imagerie à environ 175 s et le 3 ^ème et 4 ^ème images (180 s et 220 s) montre une augmentation rapide de la [Ca ^{2 +] i} (fluorescence), originaires de la tête et du cou postérieure de la cellule. Après les images sont à 290, 360, 740, 990 et 1440 s, montrant la décomposition de la première [Ca ^{2 +]} i transitoire et le développement d'une élévation secondaire soutenue. La figure 2 montre une analyse de tableur, de convertir les valeurs brutes de fluorescence pour chaque ROI à la fluorescence normalisée (variation en% de la fluorescence par rapport à la période de contrôle) La figure 3 montre le temps normalisé parcelles de fluorescence pour 3 cellules montrant «typique» des réponses à trois progestérone uM.

Figure 1. Exemple de données à partir d'un cellulaire stimulée par la progestérone. Une série d'images de fluorescence en échelle de gris (rangée du haut) et pseudo (rangée du bas) sont affichés. Points de temps sont de 0, 180, 220, 290, 360 et 990. 3 progestérone uM entra dans la chambre d'imagerie à 175 s. ROIs sont présentés dans le premier panneau.

Figure 2. Analyse de données unique de fluorescence de cellules dans Excel. Les chiffres en noir sont des séries chronologiques de données de fluorescence, disposées verticalement. Les chiffres en rouge (ci-dessous) sont des données normalisées obtenues en utilisant l'équation donnée dans le texte. Le graphique montre la fluorescence en temps normalisé parcelle pour 64 cellules dans cette expérience qui, lors de la stimulation, montre une augmentation transitoire de la fluorescence suivie d'une lente montée et une série de petites oscillations.

Figure 3. Fluorescence en temps des traces de 3 cellules individuelles, exprimée en% de changement par rapport à la valeur de contrôle .. 3 progestérone uM a été ajouté à l'heure indiquée par la flèche. La ligne pointillée montre fluorescence moyenne de commande.

Discussion

Lorsqu'elles sont menées avec succès, cette technique permet l'enregistrement de la distribution et la cinétique de spontané et induit des signaux Ca ^{2 +} dans le sperme humain. Les réponses peuvent être obtenues à partir d'un grand nombre de cellules (jusqu'à 200) qui est important car le sperme humain peut montrer beaucoup de variation dans leurs spontanée et stimulée de signaux Ca ^{2 +.} Étiquetage réussie et la survie des cellules pendant l'enregistrement sont très dépendants de la qualité de l'échantillon. Échantillons pauvres donnent mauvais étiquetage, les réponses pauvres et les cellules peuvent mourir pendant l'enregistrement.

Le sperme de l'homme sont très sensibles à la photo-dommages et nous avons donc utiliser l'éclairage minimal nécessaire (à la fois l'intensité et la durée d'exposition) afin de maximiser la survie des cellules et de minimiser les artefacts dus à la mort cellulaire. Une caméra à haute sensibilité (permettant l'utilisation de faible intensité d'éclairage) est un grand avantage puisque la caméra va ramasser la fluorescence est faible. Rétro-éclairé, EM-CCD sont particulièrement bien adaptée, bien que très coûteux. L'éclairage par DEL (au lieu d'utiliser une lampe au xénon ou au mercure avec filtre d'excitation améliore également la survie cellulaire (Nishigaki et al, 2006).

Nous n'utilisons pas de Fura-2, malgré les avantages évidents de ratio-métrique d'imagerie, car Fura nécessite excitation avec une lumière UV et parce qu'il est nécessaire de prendre deux images pour chaque rapport. Pour les données obtenues avec seule longueur d'onde, les colorants de la lumière visible, la normalisation de l'intensité de fluorescence compense largement la différence dans le colorant de charge entre les cellules, mais pas pour la distribution colorant dans une cellule individuelle, et cela doit être pris en compte. Bien que les colorants seule longueur d'onde peut, en principe, être calibré, la précision de la technique est mauvaise et nous ne tentons pas de faire cela.

Considérant que les données obtenues avec rapport de Fura-2 (ou l'émission ratio de colorant Indo), même sans calibration, donner une représentation fidèle de manière acceptable les changements relatifs dans [Ca ^{2 +]} i, l'intensité de fluorescence des colorants seule longueur d'onde est loin d'être linéaire liées à [Ca ^{2 +]} i. Plus de la partie la plus utile de la courbe de saturation de la relation pour les teintures seule longueur d'onde se rapproche généralement logarithmique. Nous utilisons actuellement Oregon Green BAPTA-1 (figure 4) parce qu'il est sensible aux petits changements de [Ca ^{2 +]} i près de repos au niveau de l (50-100 nM). Lorsque [Ca ^{2 +]} i monte au dessus de 1 uM réponses seront sous-représentés en termes de changement de fluorescence et le colorant peut saturer. Une option pour l'amélioration de la technique sans recourir à une excitation UV est de doubler les cellules de charge avec un colorant tel que Fluo-3 et Fura rouge. Les deux peuvent être excités à 488 nm mais simultanées leurs réponses sont très différentes. Enregistrement de l'émission à 540 et 650 nm offre un rapport qui peut fournir une meilleure méthode pour un suivi précis de [Ca ^{2 +]} i (Haughland, 2002) et peut être applicable aux spermatozoïdes (Nisigaki et al, 2006).

Figure 4. Relation entre libre [Ca ^{2 +]} (nm) et émission de fluorescence à pic de longueur d'onde (environ 525 nm) pour Oregon Green BAPTA-1 et Oregon Green BAPTA-2. OGB1 donne plus de fluorescence à se reposer [Ca ^{2 +],} mais sature à des niveaux inférieurs et donc a une plus petite plage utilisable. Les données de ces parcelles ont été obtenues à partir des sondes moléculaires manuel (Haughland, 2002).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low light level Camera	QImaging	Rolera XR
Oregon Green BAPTA-1	Invitrogen	06807
Imaging Software	Andor	IQ
Imaging Software	National Institutes of Health	Image J	Public domain software
LED illumination system	Cairn Research	Opto LED
Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)	Invitrogen	P3000MP