Techniques for Imaging Ca ^{2 +} Signaling in menschlichen Spermien

Summary

Stimulus-evozierte [Ca

Abstract

Fluoreszenz-Mikroskopie von Zellen mit fluoreszierenden, Ca geladen

Protocol

Sperma von gesunden fruchtbaren Männchen, mit einem normalen Spermiogramm, sind in der Regel für die Bildgebung wie folgt hergestellt.

1. Semen Proben werden bei 37 ° C nicht länger als 30 min gespeichert. 1,8 CaCl ₂ .2 H ₂ O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 26,2 NaHCO _3, 1,0 NaH ₂ PO _4: mM; Zellen werden aus der Samenflüssigkeit von Swim-up in ergänzt balanced salt Earle-Lösung (sEBSS isoliert. 2H ₂ O, 116,4 NaCl, 55,6 D-Glucose, 2,73 Na-Pyruvat, 41,8 Na-Lactat) mit 0,3% Holzkohle de-lipidated/fatty säurefrei Fraction V BSA (Qualität der BSA ist Voraussetzung für erfolgreiche Kapazitation der Spermien) ergänzt. 1 ml der sEBBS ist in jedem der eine Reihe von 5 ml pipettiert und vorsichtig mit 0,3 ml des Samens underlayered. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde (37 ° C, 6% CO ₂₎ der oberen 0,7 ml wird sanft aus jedem Rohr entfernt und gepoolt. 10 ul der Spermien-Suspension mit 90 ul 1% (v / v) Formalin, um die Zellen zu immobilisieren verdünnt wird, dann Spermien werden in einer Neubauer-Kammer gezählt. Die Zelldichte in der Suspension wird dann angepasst (mit sEBSS) bis 6 Millionen Zellen / ml.
2. In für 5-6 h auf Kapazitation zu ermöglichen.; Die Probe wird dann in Aliquots von 200 ul in locker-Röhrchen mit und inkubiert (6% CO ₂ 37 ° C) unterteilt
3. Deckgläser (22X50 mm) haben zuvor mit Poly-D-Lysin behandelt worden. 10 ul der Poly-D-Lysin-Lösung (10% w / v) wird als eine Reihe von kleinen Tropfen in die Mitte des Deckglases aufgetragen. Die Poly-D-Lysin wird dann an der Luft getrocknet. Dies kann auf einem beheizten Bühne zu stehen und sollte bis zur vollständigen Trockne. . Ähnlich wie die Warner RC20 Kammer Die Poly-D-Lysin, einem Deckglas wird mit Vakuum-Fett auf einem geschlossenen, für diesen Zweck gebaut, perfundierbaren, Polycarbonat Bildgebung Kammer (Kapazität ≈ 180 ul Abmessungen 35 mm x 20 mm x 5 mm) befestigt beschichteten Deckglas bildet die Basis der Kammer, wenn die Zellen auf einem inversen Mikroskop betrachtet und ein 12 mm Durchmesser kreisförmigen Deckglas bildet die Oberseite der Kammer, so dass Lichtdurchlässigkeit.
4. Oregon Green BAPTA1-AM (OGB) oder Calcium Green 1-AM für die Markierung von Zellen eingesetzt. OGB wird durch Lösen in DMSO. Pluronic F127 Säure (ein Waschmittel) ist in der DMSO aufgenommen, um "Verklumpung" des Farbstoffes zu verhindern. Dies kann im Labor (100 mg Pluronic in 0,5 ml DMSO) hergestellt werden, unmittelbar vor dem Gebrauch oder kann bestellt vorbereitete werden. 20 pl ist es, eine 50 ug Aliquot OGB (2,5 mg / ml) aufgenommen. Das Fläschchen kann dann gespeichert werden eingefroren und wieder aufgetaut für den späteren Gebrauch werden.
5. Nach Kapazitation der Spermien (5-6 h in sEBBS, 37 ° C, 6% CO ₂₎ ein Rohr für die Bildgebung und 1,2 ul der OGB-Lösung ausgewählt wird, wird hinzugefügt, was zu einer Endkonzentration von 10 uM. Das Rohr wird dann für weitere 40 min inkubiert, wonach die Zellsuspension vorsichtig in die Einströmöffnung der Bildgebung Kammer mit einem p1000 (blau) Pipettenspitze injiziert. Die Kammer ist in den Inkubator, Poly-D-Lysin-beschichtete Deckglas nach unten, für 20 min gestellt. Zellen neigen dazu, entlang der Oberflächen der Kammer schwimmen und wird dem Poly-D-Lysin-beschichtete Fläche haften.
6. Die Kammer ist nun auf dem Mikroskop montiert, angeschlossen an die Perfusionsapparatur und perfundierten mit ca. 0,5 ml / min. Eine Walze Pumpe fördert Kochsalzlösung in die Kammer-und Überlauf von der Ausfahrt Port durch eine Saugpumpe mit trap wird entfernt. Die Zubereitung ist im Dunkeln für mindestens 10 min nach links, während lose Zellen und extrazellulären Farbstoff durch Perfusion der Kammer entfernt werden. Temperaturbeständigkeit ist von entscheidender Bedeutung, weil kleine Schwankungen können nicht nur die Ca ^{2 +-Homöostase,} sondern kann auch Auswirkungen auf K _d des Farbstoffs. Experimente sind in der Regel bei 25 ° C, erreicht, indem die Temperatur der dunklen Raum auf dieser Ebene. Wir haben festgestellt, dass die Aufrechterhaltung Raumtemperatur auf dem erforderlichen Niveau bietet größere Temperatur und Konzentration Stabilität als mit einer Temperatur gesteuert Bühne oder eine thermostatisch gesteuerte Heizung auf der Saline Zufluss.
7. Die Zellen werden unter Phasenkontrast (40x oder 60x Öl-Immersion) Ziel und einen Bereich für die Bildgebung gewählt wird angezeigt. Der Anteil der Poly-D-Lysin beschichtete Fläche, die in der Nähe der Einlassöffnung ist bevorzugt, wobei Kochsalzlösung Strömung laminar und konsequent. Es ist auch wichtig, um ein Gebiet, wo Zelldichte angemessene Verwendung (zu hohe Dichte wirkt sich auf die Qualität und Integrität der Daten durch Abholung des Signals von benachbarten Zellen) und in denen Zellen ausreichend befestigt, sondern Flagellen Aktivität erkennbar ist. Ein Phasenkontrast-Bild wird gespeichert. Und Belichtungszeit auf das erforderliche Minimum, um eine klare Fluoreszenzbild (in der Regel 50-200 ms) zu erhalten reduziert wird; Das Mikroskop wird dann zur Fluoreszenz-Modus (Emission 540 nm Anregung 480 nm) eingeschaltet.
8. Das Experiment wird durch die Aktivierung der Zeitreihen-Bildaufnahme-Software (IQ) gestartet. Typischerweise Bilder bei 0,1 Hz erfasst und Beleuchtung ist es, die Zeit der Bildaufnahme nur eingeschränkt mit Hilfe eines Software gesteuertem Verschluss. Viel größer Bildaufnahmeraten kann verwendet werden, aber Zulage muss für Probleme der Bleiche und der Erzeugung von Artefakten durch Foto-Schäden an den Zellen (siehe Diskussion) vorgenommen werden. IQ (und die meisten anderen Akquisition Software-Plattformen) werden in Echtzeit grafische Darstellung der Fluoreszenz während des Experiments zu ermöglichen.
9. Nach einer Kontrolle Zeitraum von 3-5 Minuten Dauer Manipulation von Kochsalzlösung Bestandteile (z. B. [Ca ^{2 +]} _o) und Applikation von Medikamenten wird durch Ersatz von Kochsalz in der Perfusion Header erreicht. Zeitpunkt der Zugabe der einzelnen Stimulus wird darauf hingewiesen, so dass die Zeit der Ankunft in der Imaging-Kammer berechnet werden kann, eine ausreichende Genauigkeit für die Beurteilung der langsamen Reaktionen hier beschriebene (abgetastet bei 0,1 Hz). Für weitere schnelle Reaktionen eine höhere Genauigkeit kann durch Zugabe von Stimuli direkt an der Saline durch eine zweite Einströmöffnung wie in der Warner RC20 Kammer vorgesehen erreicht werden.
10. Die Bilder werden analysiert offline mit IQ. Regions of Interest (ROI) sind rund jeder Zelle (oder einen Teil der Zelle) gezogen und auch eine Zelle frei ist angewählt (für die automatische Subtraktion des Hintergrundes durch die Software. Die Bildserie wird dann überprüft werden, um Zellen, die starben oder unterzog Akrosomreaktion zu entfernen ( die erscheint als eine starke und rasche Zunahme der Fluoreszenz durch den Verlust der zytoplasmatischen Farbstoff) während des Experiments und diejenigen, die ausreichende Bewegung, um Artefakte zu verursachen, wenn sie als Zeitreihen analysiert zeigte gefolgt.
11. Eine Zeit-Fluoreszenzintensität Serie wird dann für jede ROI erzielt und diese Daten werden in Excel analysiert offline. Zunächst Fluoreszenz wird auf den Mittelwert während der Kontrollperiode erhalten normalisiert, mit der Gleichung R = [(FF _rest) / F _Rest] x 100%, wobei R% Veränderung der Fluoreszenz ist im Vergleich zur Kontrollgruppe Zeit, F ist Fluoreszenzintensität zu einem Zeitpunkt t und F _Rest ist der Mittelwert von mindestens 30 Bestimmungen des F während der Kontrollperiode erhalten.

Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine Serie von Bildern aus einem Experiment, in dem die Zellen mit 3 uM Progesteron stimuliert wurden. Die obere Zeile und Film 1 zeigen die Fluoreszenz-Bildern in Graustufen-und derselben Magier sind unten (und in Film 2) in Falschfarben dargestellt (Lookup-Tabelle '16_colors "in Image J), ​​wo 'cool' Farben niedrige Fluoreszenzintensität zeigen und 'warm' Farben zeigen hohe Fluoreszenzintensität. Die Zellen können in Falschfarben während des Experiments betrachtet werden, mit Lookup-Tabellen in IQ, sondern mit Graustufen ist in der Regel aussagekräftiger für die Bewertung. Ob die Zellen gut beschriftet sind. Die ersten beiden Bilder wurden bei 0 s und 100 s nach Beginn der Aufzeichnung gesammelt. Fluoreszenz sollte stabil und neigt dazu, am stärksten in der post akrosomalen Bereich und Spermien Hals. Progesteron in die Bildgebung Kammer bei ca. 175 s und die ^3. und ^4. Bilder (180 s und 220 s) zeigt einen raschen Anstieg der [Ca ^{2 +] i} (Fluoreszenz) mit Ursprung in den hinteren Kopf-und Halsregion der Zelle. Nachfolgende Bilder sind bei 290, 360, 740, 990 und 1440 s, zeigt den Verfall der ursprünglichen [Ca ^{2 +]} i transient und Entwicklung einer sekundären anhaltende Erhöhung. Abbildung 2 zeigt eine Tabellenkalkulation, Umwandlung von Roh-Fluoreszenz-Werte für jede ROI zu normalisierten Fluoreszenz (% Veränderung der Fluoreszenz im Vergleich zur Kontrollgruppe Periode) Abbildung 3 zeigt die Zeit-normalisierte Fluoreszenz Parzellen für 3 Zellen zeigen "typische" Reaktionen auf 3 uM Progesteron.

Abbildung 1. Beispiel Daten aus einer Zelle mit Progesteron stimuliert. Eine Reihe von Fluoreszenz-Bildern in Graustufen (obere Reihe) und Falschfarbendarstellung (untere Reihe) gezeigt werden. Zeitpunkten 0, 180, 220, 290, 360 und 990er. 3 uM Progesteron in die Bildgebung Kammer bei 175 s. ROIs sind in der ersten Tafel dargestellt.

Abbildung 2. Analyse der einzelnen Zelle Fluoreszenz-Daten in Excel. Die Zahlen in schwarz sind Zeitreihen von Fluoreszenz-Daten, vertikal angeordnet. Die Zahlen in rot (unten) sind normalisierten Daten unter Verwendung der Gleichung im Text angegeben. Graph zeigt normalisierte Fluoreszenz-Zeit-Diagramm für die Zelle 64 in diesem Experiment, das nach Stimulation zeigt einen vorübergehenden Anstieg der Fluoreszenz, die durch einen langsamen Anstieg und eine Reihe von kleinen Schwingungen folgen.

Abbildung 3. Fluoreszenz-time Spuren für 3 einzelne Zellen, wie Veränderung in% in Bezug auf Wert-Regelung zum Ausdruck gebracht .. 3 uM Progesteron war zu der Zeit durch den Pfeil markiert aufgenommen. Eine gestrichelte Linie zeigt die mittlere Kontrolle Fluoreszenz.

Discussion

Als erfolgreich durchgeführt, ermöglicht diese Technik die Aufnahme des Vertriebs und der Kinetik der spontanen und induzierten Ca ^{2 +-Signale} in menschlichen Spermien. Die Antworten können aus einer großen Anzahl von Zellen (bis 200), die wichtig ist, da menschliche Spermien können eine Menge von Variationen in ihre spontane und stimulierte Ca ^{2 +-Signale} zeigen, gewonnen werden. Erfolgreiche Kennzeichnung und Überleben der Zellen während der Aufnahme sind hochgradig abhängig von Sample-Qualität. Schlechte Beispiele gibt schlechte Kennzeichnung, schlechte Antworten und Zellen können während der Aufnahme sterben.

Menschliche Spermien sind sehr empfindlich auf Foto-Schäden und wir daher den minimal erforderlichen Beleuchtung (sowohl Intensität und Belichtungszeit), um das Überleben der Zelle zu maximieren und minimieren Artefakte durch Zelltod. Eine hochempfindliche Kamera (erlaubt Einsatz von Low-Intensity-Beleuchtung) ist ein großer Vorteil, da die Kamera holt schwache Fluoreszenz. Back-beleuchteten, sind EM-CCD-Kameras besonders gut geeignet, wenn auch sehr teuer. LED-Beleuchtung (anstelle der Verwendung einer Xenon-oder Quecksilber-Lampe mit Anregungsfilter verbessert auch das Überleben der Zelle (Nishigaki et al, 2006).

Wir verwenden keine Fura-2, trotz der offensichtlichen Vorteile von ratio-metrischen Bildgebung, da Fura erfordert Anregung mit UV-Licht und weil es notwendig, zwei Bilder für jedes Verhältnis zu nehmen. Für Daten mit einer Wellenlänge, sichtbares Licht Farbstoffe, die Normalisierung der Fluoreszenz-Intensität weitgehend kompensiert Unterschied in der Farbstoff-Laden zwischen den Zellen, nicht aber für Farbverteilung innerhalb einer einzelnen Zelle, und dies muss berücksichtigt werden, erhalten. Obwohl einzelne Wellenlänge Farbstoffe können im Prinzip kalibriert werden, ist die Genauigkeit des Verfahrens Armen und wir versuchen nicht, dies zu tun.

Während das Verhältnis von Daten mit Fura-2 (oder die Emission Verhältnis Farbstoff Indo) erhalten, auch ohne Kalibrierung, geben einen akzeptablen getreue Darstellung der relativen Veränderungen in [Ca ^{2 +]} i, ist die Fluoreszenz-Intensität der einzelnen Wellenlängen Farbstoffe weit von linear bezogen auf [Ca ^{2 +]} i. In den nützlichsten Teil der Sättigungskurve die Beziehung zur einzigen Wellenlänge Farbstoffe in der Regel nähert sich logarithmisch. Wir verwenden derzeit Oregon Green BAPTA-1 (Abbildung 4), weil sie empfindlich auf kleine Änderungen in ist [Ca ^{2 +]} i in der Nähe von Ruhepegel s (50-100 nM). Wenn [Ca ^{2 +]} i steigt über 1 uM Reaktionen werden in Bezug auf die Fluoreszenz-Änderung und der Farbstoff unterrepräsentiert kann zu sättigen. Eine Option für die Verbesserung der Technik, ohne auf UV-Anregung ist Wägezellen mit einem Farbstoff wie Fluo-3 und Fura roten Doppeldecker. Beides kann bei 488 nm angeregt werden, aber gleichzeitig ihre Reaktionen sind sehr unterschiedlich. Aufzeichnung der Emission bei 540 und 650 nm liefert ein Verhältnis, das eine bessere Methode für die genaue Überwachung der liefern kann [Ca ^{2 +]} i (Haughland, 2002) und kann für Spermien (Nisigaki et al, 2006).

Abbildung 4. Beziehung zwischen freien [Ca ^{2 +]} (nM) und Fluoreszenz-Emission bei Peakwellenlänge (ca. 525 nm) für Oregon Green BAPTA-1 und Oregon Green BAPTA-2. OGB1 ergibt eine höhere Fluoreszenz bei ruhenden [Ca ^{2 +],} sondern sättigt auf den unteren Ebenen und hat somit eine geringere nutzbare Bandbreite. Die Daten für diese Grundstücke wurden von der Molecular Probes Handbuch (Haughland, 2002) erhalten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low light level Camera	QImaging	Rolera XR
Oregon Green BAPTA-1	Invitrogen	06807
Imaging Software	Andor	IQ
Imaging Software	National Institutes of Health	Image J	Public domain software
LED illumination system	Cairn Research	Opto LED
Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)	Invitrogen	P3000MP