Summary
Estímulo evocado [Ca
Abstract
Microscopía de fluorescencia de células cargadas con fluorescentes, Ca
Protocol
El esperma de los machos fértiles sanos, con un análisis de semen normal, normalmente se preparan para obtener imágenes de la siguiente manera.
- Las muestras de semen se almacenan a 37 ° C durante no más de 30 min. Las células son aisladas del plasma seminal de desplazarse hacia el interior complementado Earle solución salina balanceada (sEBSS; mM: 1.8 de CaCl 2 .2 H 2 O, 5.37 KCl, 0,81 MgSO 4 .7 H 2 O, 26,2 NaHCO3, 1,0 NaH 2 PO 4. 2H 2 O, NaCl 116,4, 55,6 D-glucosa, piruvato 2,73 Na, Na 41,8 lactato) suplementado con 0,3% de carbón de-lipidated/fatty ácido libre Fracción V de BSA (la calidad de la BSA es crucial para el éxito de la capacitación de los espermatozoides). 1 ml de sEBBS se pipeta en cada uno de una serie de tubos de 5 ml y suavemente underlayered con 0,3 ml de semen. Después de la incubación durante 1 hora (37 ° C, 6% de CO 2) de la parte superior de 0,7 ml se quita suavemente de cada tubo y se agruparon. 10 l de la suspensión de esperma se diluye con 90 l de 1% (v / v) de formol para inmovilizar las células, los espermatozoides son contados en una cámara Neubauer. La densidad de células en la suspensión se ajusta (con sEBSS) a 6 millones de células / ml.
- La muestra se divide en partes alícuotas de 200 l en tubos sin apretar con tapa y se incubaron (37 ° C, 6% de CO 2) en durante 5-6 horas para permitir la capacitación.
- Cubreobjetos (22x50 mm) han sido tratados previamente con poli-D-lisina. 10 l de poli-D-lisina solución (10% w / v) se aplica como una serie de pequeñas gotas en el centro del cubreobjetos. La poli-D-lisina se deja secar al aire. Esto puede ser en un escenario calentado y se debe a la desecación completa. Un cubreobjetos se adjunta con grasa de vacío de un espacio cerrado, construido, cámara de perfusable, policarbonato imagen (dimensiones 35 mm x 20 mm x 5 mm, capacidad de ≈ 180 l). Similar a la cámara Warner RC20 La poli-D-lisina cubreobjetos recubiertos forma la base de la cámara cuando las células se ven en un microscopio invertido y un 12 mm de diámetro circular cubreobjetos forma la superficie superior de la cámara, que permite la transmisión de la luz.
- Oregon Green BAPTA1-AM (OGB) o calcio Verde 1-AM se utilizan para las células de etiquetado. OGB se prepara disolviendo en DMSO. Pluronic F127 ácido (un detergente) está incluido en el DMSO para evitar el "agrupamiento" de la tintura. Esto puede ser preparado en el laboratorio (100 Pluronic mg en 0,5 ml de DMSO), inmediatamente antes de su uso, o se pueden comprar ya preparadas. 20 l se añade a una alícuota de 50 g de OGB (2,5 mg / ml). El vial se pueden almacenar congelados y descongelados para su uso posterior.
- Después de la capacitación de los espermatozoides (5-6 h en sEBBS, 37 ° C, 6% de CO 2) se selecciona un tubo de imagen y 1,2 l de solución de OGB se añade, dando una concentración final de 10 mM. El tubo se incuba durante 40 min, tras lo cual la suspensión celular se inyecta suavemente en el puerto de entrada de la cámara de imágenes con un p1000 (azul) punta de la pipeta. La cámara se coloca en el lado del cubreobjetos incubadora, poli-D-lisina abajo, durante 20 minutos. Las células tienden a nadar a lo largo de las superficies de la cámara y se adhiere a la zona de poli-D-lisina.
- La cámara está montada en el microscopio, conectado con el aparato de perfusión y perfundidos a aproximadamente 0,5 ml / min. Una bomba de rodillo de alimentación de solución salina en la cámara y el desbordamiento de la puerta de salida se elimina mediante una bomba de aspiración con trampa. La preparación se deja en la oscuridad durante al menos 10 minutos mientras que las células sueltas y tinte extracelular se eliminan mediante la perfusión de la cámara. Estabilidad de la temperatura es muy importante porque las pequeñas fluctuaciones, no sólo puede afectar a células de Ca 2 + homeostasis, pero también puede afectar K d de la tintura. Los experimentos se realizan normalmente a 25 ° C, logra manteniendo la temperatura de la habitación a oscuras en este nivel. Hemos encontrado que el mantenimiento de la temperatura ambiente en el nivel requerido proporciona una mayor estabilidad de la temperatura y la concentración que utilizando una etapa de control de temperatura o un calentador con termostato en la entrada de solución salina.
- Las células son examinadas bajo contraste de fase (40x o 60x de inmersión en aceite) objetivo y un área de imagen seleccionada. La porción de la superficie recubierta con poli-D-lisina que se encuentra cerca del puerto de entrada se prefiere, donde el flujo de solución salina es laminar y consistente. También es importante la utilización de una zona donde la densidad celular es el adecuado (densidad excesiva afecta la calidad y la integridad de los datos a través de la captación de la señal de las células adyacentes) y donde las células están debidamente conectados, pero la actividad flagelar es discernible. Una imagen de contraste de fase se guarda. El microscopio es entonces cambia al modo de fluorescencia (excitación 480 nm, emisión 540 nm) y el tiempo de exposición se reduce a la mínima requerida para obtener una imagen clara de fluorescencia (generalmente 50-200 ms).
- El experimento se inicia con la activación del software de imágenes de series de tiempo de adquisición (IQ). Normalmente, las imágenes se adquieren a 0,1 Hz y la iluminación se limita a los períodos de adquisición de imágenes sólo con un software obturador controlado. Mucho mayores tasas de adquisición de imágenes se pueden utilizar, pero deberá tenerse en cuenta los problemas de la decoloración y la generación de artefactos debido a la foto-daño a las células (véase la discusión). IQ (y la mayoría de otras plataformas de software de adquisición) permitirá en tiempo real, gráficos de fluorescencia durante el experimento.
- Después de un período de control de la manipulación de 3-5 minutos de duración de los componentes de solución salina (por ejemplo, [Ca 2 +] o) y la aplicación de los medicamentos se logra mediante el reemplazo de la solución salina en la cabecera de la perfusión. Momento de la adición de cada estímulo se observa lo que el tiempo de llegada en la cámara de imágenes se puede calcular, proporcionando la suficiente precisión para la evaluación de las respuestas lentas se describe aquí (muestra a 0,1 Hz). Para una respuesta más rápida una mayor precisión se puede lograr mediante la adición de estímulos directamente al flujo de solución salina a través de un puerto de entrada de segundo de lo dispuesto en la cámara de Warner RC20.
- Las imágenes son analizadas en línea con el CI. Las regiones de interés (ROI) se extraen alrededor de cada celda (o parte de la célula) y también una zona libre de células se ha seleccionado (por sustracción automática de fondo por el software. La serie de imágenes se comprueba para eliminar las células que murieron o recibieron la reacción del acrosoma ( que aparece como un aumento importante y rápido en la fluorescencia seguida por la pérdida de colorante citoplasmática) durante el experimento y los que mostraron el movimiento suficiente para que los artefactos cuando se analiza como una serie de tiempo.
- Una serie de tiempo-intensidad de fluorescencia se obtiene entonces para cada ROI y se analizan estos datos en línea en Excel. Inicialmente, la fluorescencia se normaliza al valor medio obtenido durante el período de control, usando la ecuación R = [(FF resto) / F resto] x 100%, donde R es el cambio en la fluorescencia% en comparación con el período de control, F es la intensidad de fluorescencia en un tiempo t y el resto F es la media de al menos 30 determinaciones de F obtenidos durante el período de control.
Resultados representante
La figura 1 muestra una serie de imágenes de un experimento en el que las células fueron estimuladas con progesterona M 3. En la fila superior y una película muestran las imágenes de fluorescencia en una escala de grises y los magos mismo se muestran a continuación (y en la película de 2) en pseudocolor (búsqueda '16_colors mesa "en la imagen J), donde 'cool' de colores indican la intensidad de fluorescencia baja y "caliente" colores indican la intensidad de fluorescencia de alta. Las células se pueden ver en pseudocolor durante el experimento, utilizando tablas de consulta en el coeficiente intelectual, pero usando la escala de grises en general es más informativo para evaluar. Si las células están bien etiquetados. Las dos primeras imágenes se obtuvieron a 0 s y s 100 después de comenzar la grabación. Fluorescencia debe ser estable y tiende a ser más fuertes en la zona posterior del cuello y acrosomal de espermatozoides. La progesterona entró en la cámara de imágenes a unos 175 s, y la 3 ª y 4 ª imagen (180 s, y s 220) muestra un rápido aumento de [Ca 2 +] i (fluorescencia), originarios de posterior de la cabeza y el cuello de la célula. Las imágenes siguientes son de 290, 360, 740, 990 y 1440 s, mostrando la decadencia de la inicial [Ca 2 +] i transitorios y el desarrollo de una elevación sostenida secundaria. La figura 2 muestra un análisis de hojas de cálculo, la conversión de crudos valores de fluorescencia para cada ROI de fluorescencia normalizada (% de cambio en la fluorescencia en comparación con el período de control) La figura 3 muestra normalizada tiempo-parcelas de fluorescencia de 3 celdas que muestra "típico" de las respuestas a la progesterona M 3.
Figura 1. Datos de ejemplo de una célula estimulada con progesterona. Una serie de imágenes de fluorescencia en la escala de grises (fila superior) y pseudocolor (fila inferior) se muestran. Momentos son 0, 180, 220, 290, 360 y 990. 3 progesterona M entró en la cámara de imágenes a 175 s. Rendimiento de la inversión se muestran en el primer panel.
Figura 2. Análisis de datos única de fluorescencia de células en Excel. Las cifras en negro son series temporales de datos de fluorescencia, de forma vertical. Las cifras en rojo (abajo) son los datos normalizados obtenidos utilizando la ecuación dada en el texto. El gráfico muestra la normalización de fluorescencia en tiempo parcela de 64 células en este experimento que, a la estimulación, muestra un aumento transitorio de la fluorescencia seguida por un aumento lento y una serie de pequeñas oscilaciones.
Figura 3. Fluorescencia a tiempo las huellas de tres celdas individuales, expresado en% de variación con respecto al control de valor .. 3 progesterona M se añadió en el tiempo marcado por la flecha. De puntos muestra la línea media de fluorescencia de control.
Discussion
Cuando se lleva a cabo con éxito, esta técnica permite la grabación de la distribución y la cinética de espontánea e inducida de Ca 2 + señales en el esperma humano. Las respuestas pueden ser obtenidos a partir de un gran número de células (hasta 200) lo cual es importante ya que el esperma humano puede mostrar una gran variación en su espontánea y estimulada Ca 2 + señales. Etiquetado de éxito y supervivencia de las células durante la grabación dependen en gran medida la calidad de la muestra. Muestras pobres dan etiquetado deficiente, las respuestas de los pobres y las células pueden morir durante la grabación.
Los espermatozoides humanos son muy sensibles a la foto-daño y por lo tanto, el uso de la iluminación mínima necesaria (tanto en intensidad y tiempo de exposición) con el fin de maximizar la supervivencia de las células y reducir al mínimo los artefactos debido a la muerte celular. Una cámara de alta sensibilidad (que permite el uso de la iluminación de baja intensidad) es un gran beneficio ya que la cámara tomará la fluorescencia débil. Retroiluminado, EM-CCD cámaras están particularmente bien adaptado, aunque muy caro. La iluminación por LED (en lugar de utilizar una lámpara de mercurio o de xenón, con filtro de excitación también mejora la supervivencia de las células (Nishigaki et al, 2006).
Nosotros no usamos Fura-2, a pesar de las evidentes ventajas de la relación de la métrica de imagen, ya que requiere Fura excitación con luz ultravioleta, y porque es necesario tomar dos imágenes para cada relación. Por los datos obtenidos con la longitud de onda única, tintes de luz visible, la normalización de la intensidad de fluorescencia en gran medida compensa la diferencia en la carga de tintes entre las células, pero no para la distribución de medio de contraste dentro de una celda individual, y esto debe tenerse en cuenta. A pesar de los tintes sola longitud de onda puede, en principio, ser calibrado, la precisión de la técnica es pobre y que no intente hacer esto.
Considerando que la relación de los datos obtenidos con Fura-2 (o la emisión relación tinte indo), aún sin calibración, dar una representación aceptable fiel de los cambios relativos en el [Ca 2 +] i, la intensidad de fluorescencia de los tintes sola longitud de onda está lejos de ser lineal relacionados con la [Ca2 +] i. Sobre la parte más útil de la curva de saturación de la relación de tintes sola longitud de onda por lo general se aproxima a la logarítmica. En la actualidad utilizamos Oregon Green BAPTA-1 (Figura 4), ya que es sensible a pequeños cambios en la [Ca 2 +] i en reposo cerca de nivel s (50-100 nm). Cuando la [Ca2 +] i se eleva por encima de 1 mM respuestas serán representadas en términos de cambio de fluorescencia y el colorante pueden saturar. Una opción para la mejora de la técnica sin tener que recurrir a la excitación UV es duplicar las células de carga con un tinte como Fluo-3 y el rojo Fura. Ambos se pueden excitar a 488 nm, pero simultáneamente sus respuestas son muy diferentes. Grabación de la emisión a 540 y 650 Nm proporciona una relación que puede proporcionar un mejor método para un control preciso de la [Ca2 +] i (Haughland, 2002) y puede ser aplicable a los espermatozoides (Nisigaki et al, 2006).
Figura 4. Relación entre la libre [Ca 2 +] (nm) y de emisión de fluorescencia en el pico de longitud de onda (aproximadamente 525 nm) de Oregon Green BAPTA-1 y Oregon Green BAPTA-2. OGB1 da una mayor fluorescencia en reposo [Ca 2 +], pero se satura en los niveles inferiores y por lo tanto tiene un menor rango utilizable. Los datos de estas parcelas se obtuvieron de Molecular manual de sondas (Haughland, 2002).
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo está financiado por el Wellcome Trust, el Consejo de Investigación Médica, de la Royal Society, Birmingham Science City y la confianza que la infertilidad de Investigación. Nos gustaría agradecer la asistencia de expertos de la investigación Cairn en la construcción y la integración de los equipos de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low light level Camera | QImaging | Rolera XR | |
| Oregon Green BAPTA-1 | Invitrogen | 06807 | |
| Imaging Software | Andor | IQ | |
| Imaging Software | National Institutes of Health | Image J | Public domain software |
| LED illumination system | Cairn Research | Opto LED | |
| Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) | Invitrogen | P3000MP |
References
- Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).
- Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging. Biotechniques. 41, 191-197 (2006).
