Summary
Stimulus-framkallat [Ca
Abstract
Fluorescensmikroskopi av celler laddade med fluorescerande, Ca
Protocol
Spermier från friska fertila män, med en normal sperma analys, normalt förberedda för avbildning enligt följande.
- Sperma proverna förvaras vid 37 ° C i högst 30 min. Celler är isolerade från sädesvätskan genom att simma upp i kompletteras Earles balanserad saltlösning (sEBSS, mm: 1,8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO 4 0,7 H 2 O, 26,2 NaHCO 3, 1,0 NaH 2 PO 4. 2H 2 O, 116,4 NaCl, 55,6 D-glukos, 2,73 Na pyruvat, 41,8 Na laktat) kompletterad med 0,3% kol de-lipidated/fatty syra fria fraktionen V BSA (kvaliteten på BSA är avgörande för framgångsrik capacitation spermier). 1 ml av sEBBS är pipetteras till var och en serie av 5 ml rör och försiktigt underlayered med 0,3 ml av sperma. Efter inkubation under 1 timme (37 ° C, 6% CO 2) upp 0,7 ml är försiktigt bort från varje rör och samman. 10 ìl av spermier fjädring späds med 90 l på 1% (v / v) formalin att immobilisera cellerna, då spermier räknas i ett Neubauer kammare. Celltäthet i suspensionen justeras sedan (med sEBSS) till 6 miljoner celler / ml.
- Provet är sedan indelat i alikvoter av 200 l i löst tak rör och inkuberas (37 ° C, 6% CO 2) i för 5-6 timmar så att capacitation.
- Täckglas (22x50 mm) tidigare har behandlats med poly-D-lysin. 10 ìl av poly-D-lysin-lösning (10% w / v) används som ett antal små droppar till mitten av täckglas. Poly-D-lysin får sedan lufttorka. Detta kan vara på en uppvärmd scenen och ska till fullständig torrhet. Ett täckglas är fäst med vakuum fett till ett slutet, specialbyggda, perfusable, polykarbonat imaging kammare (mått 35 mm x 20 mm x 5 mm, kapacitet ≈ 180 l). Liknar Warner RC20 kammaren poly-D-lysin- belagda täckglas utgör basen i kammaren när celler visas på ett inverterat mikroskop och en 12 mm diameter rund täckglas bildar övre yta kammaren, så att överföring av ljus.
- Oregon Grön BAPTA1-AM (ÖGB) eller kalcium Grön 1-AM används för märkning av celler. OGB bereds genom att lösa upp i DMSO. Pluronic syra F127 (ett rengöringsmedel) ingår i DMSO att förhindra "klumpar" av färgen. Detta kan förberedas i laboratoriet (100 mg Pluronic i 0,5 ml DMSO), omedelbart före användning, eller kan köpas färdiga. 20 l läggs till en 50 mikrogram alikvot av OGB (2,5 mg / ml). Injektionsflaskan kan sedan lagras frysas och tinas för senare användning.
- Efter capacitation av spermier (5-6 h på sEBBS, 37 ° C, 6% CO 2) en slang har valts för avbildning och 1,2 l av OGB tillsätts, vilket ger en slutlig koncentration av 10 mikrometer. Röret inkuberas därefter i ytterligare 40 min, varefter cellsuspensionen försiktigt sprutas in i inflödet porten på avbildning kammare med en P1000 (blå) pipettspetsen. Kammaren placeras i inkubatorn, poly-D-lysin-belagda täckglas sidan nedåt, i 20 min. Celler har en tendens att simma längs ytor kammaren och kommer att ansluta sig till poly-D-lysin-belagda området.
- Kammaren är nu monterad på mikroskop, ansluten till perfusion apparater och perfusion vid ca 0,5 ml / min. En rulle pump matar saltlösning in i kammaren och bräddavlopp från utgångsöppningen avlägsnas genom en sugpump med fälla. Beredningen är kvar i mörker i minst 10 min medan lösa celler och extracellulära färg tas bort genom perfusion av kammaren. Temperaturen är av avgörande betydelse att små variationer kan inte bara påverkar cellens Ca2 + homeostas, men kan också påverka K D i färgen. Experiment utförs normalt vid 25 ° C, uppnås genom att upprätthålla temperaturen i det mörka rummet på denna nivå. Vi har funnit att hålla rumstemperaturen på önskad nivå ger ökad temperatur och fokus stabilitet än att använda en temperaturstyrd scen eller en termostatstyrd värmare på koksaltlösning inflödet.
- Cellerna ses under faskontrast (40x eller 60x olje-immersion) mål och ett område för avbildning är vald. Den del av poly-D-lysin belagda område som är nära inloppet är att föredra, där saltlösning laminärt flöde och konsekvent. Det är också viktigt att använda ett område där celltäthet är lämpligt (kraftig täthet påverkar kvaliteten och integriteten hos data genom hämtning av signaler från intilliggande celler) och där cellerna är tillräckligt knutna men flagellar aktivitet kan skönjas. En faskontrast bilden sparas. Mikroskopet ställs sedan om till fluorescens-läge (excitation 480 nm, utsläpp 540 nm) och exponeringstiden reduceras till det minimum som krävs för att få en tydlig fluorescens bild (vanligtvis 50-200 ms).
- Experimentet startas genom aktivering av tidsserier mjukvara Image Acquisition (IQ). Normalt bilder förvärvas på 0,1 Hz och belysning är begränsad till perioder av bilden förvärvet endast använder en softwaär styrda slutaren. Mycket större bild förvärv kurser kan användas men hänsyn måste tas till problem med blekning och generering av artefakter på grund av foto-skador på celler (se diskussion). IQ (och de flesta andra förvärv mjukvaruplattformar) kommer att möjliggöra realtid diagram av fluorescens under experimentet.
- Efter en kontroll period av 3-5 minuter varaktighet manipulation av saltlösning beståndsdelar (till exempel [Ca 2 +] o) och tillämpning av läkemedel sker genom utbyte av koksaltlösning i perfusion huvudet. Tid för tillsättningen av varje stimulus noteras så att ankomsttiden i bildbehandling kammaren kan beräknas, som ger tillräcklig noggrannhet för bedömning av den långsamma reaktioner som beskrivs här (samplas med 0,1 Hz). För snabbare svar större noggrannhet kan uppnås genom att lägga till stimuli direkt till saltlösning flödet genom en andra inflöde hamn som anges i Warner RC20 kammaren.
- Bilderna analyseras offline med hjälp av IQ. Regioner av intresse (ROI) dras runt varje cell (eller del av cellen) och även en cell fria ytan är vald (för automatisk bakgrunden subtraktion av programvaran. Bilden serien kontrolleras sedan för att avlägsna celler som dött eller genomgick acrosome reaktion ( som visas som en stor och snabb ökning av fluorescens följt av förlust av cytoplasmisk färg) under försöket och de som visade tillräcklig rörelse för att orsaka artefakter när de analyseras som en tidsserie.
- En tid-fluorescensintensiteten serien är så erhålls för varje ROI och dessa data analyseras inte i Excel. Inledningsvis fluorescens är normaliserat till medelvärdet under kontrollperioden, med hjälp av ekvationen R = [(FF vila) / F resten] x 100%, där R är% förändring i fluorescens jämfört med kontrollgruppen perioden, F är fluorescensintensiteten vid tiden t och F resten är medelvärdet av minst 30 bestämningar av F erhållits under kontrollperioden.
Representativa resultat
Figur 1 visar en serie bilder från ett experiment där cellerna stimuleras med 3 mikroM progesteron. Den övre raden och film 1 visar fluorescens bilder i gråskala och samma Mages visas nedan (och i film 2) i pseudofärger (uppslagstabell '16_colors "i Bild J), där" cool "färg indikerar låg fluorescerande intensitet och "varma" färger visar höga fluorescensintensitet. Celler kan ses i pseudofärger under försöket, med uppslagstabeller i IQ, men med gråskala är generellt mer informativ för bedömningen. Om cellerna är väl märkta. De två första bilderna togs vid 0 s och 100 s efter start inspelning. Fluorescens ska vara stabil och tenderar att vara starkast i inlägget acrosomal området och spermier hals. Progesteron in i bildbehandling kammaren vid ca 175 s och 3: e och 4 bilder: e (180 S och 220 S) visar en snabb ökning av [Ca2 +] i (fluorescens) med ursprung i bakre huvud-halsregionen av cellen. Efterföljande bilder på 290, 360, 740, 990 och 1440 s, visar sönderfallet av den ursprungliga [Ca 2 +] Jag övergående och utveckling av en sekundär ihållande höjd. Figur 2 visar ett kalkylblad analys, som omvandlar råsocker fluorescens värden för varje ROI till normaliserad fluorescens (% förändring fluorescens jämfört med kontrollgruppen perioden) Figur 3 visar tid normaliserade fluorescens tomter för 3 celler visar "typiska" svar på 3 mikroM progesteron.
Figur 1. Exempel på data från en cell stimuleras med progesteron. En serie av fluorescens bilder i gråskala (övre raden) och pseudofärger (nedre raden) visas. Tidpunkter 0, 180, 220, 290, 360 och 990-talet. 3 mikroM progesteron in i bildbehandling kammare på 175 S. ROI visas i den första panelen.
Figur 2. Analys av enstaka uppgifter cell fluorescens i Excel. Siffror i svart är tidsserier av fluorescens data vertikalt. Siffror i rött (nedan) är normaliserade data som erhållits med hjälp av ekvationen i texten. Diagrammet visar normaliserade fluorescens-time tomt för cell 64 i detta experiment som vid stimulering, visar en övergående ökning av fluorescens följt av en långsam uppgång och serier av små svängningar.
Figur 3. Fluorescens-time spår för 3 enskilda celler, uttryckt som% förändring i förhållande till styrning värde .. 3 mikroM progesteron lades vid den tidpunkten markeras av pilen. Streckad linje visar medelvärdet kontroll fluorescens.
Discussion
När genomförs framgångsrikt, kan denna teknik inspelning av distribution och kinetik spontan och inducerad Ca 2 +-signaler i mänskliga spermier. Svar kan erhållas från ett stort antal celler (upp till 200) vilket är viktigt eftersom mänskliga spermier kan visa en hel del variation i deras spontana och stimuleras Ca 2 +-signaler. Lyckad märkning och överlevnad av celler under inspelningen är starkt beroende på provets kvalitet. Dålig prov ger dålig märkning, dålig respons och celler kan dö under inspelningen.
Mänskliga spermier är mycket känslig för foto-skador och vi därför använda de minimala nödvändiga belysningen (både intensitet och exponeringstid) för att maximera cellöverlevnad och minimera artefakter på grund av celldöd. En hög känslighet kamera (som tillåter användning av lågintensiv belysning) är en stor fördel då kameran kommer att plocka upp svag fluorescens. Bakgrundsbelyst, EM-CCD-kameror är särskilt väl lämpad, men mycket dyrt. LED-belysning (istället för att använda en xenon eller kvicksilverlampa med excitation filter förbättrar också cellöverlevnad (Nishigaki et al, 2006).
Vi använder inte Fura-2, trots de uppenbara fördelarna med ratio-metriska bildbehandling, eftersom Fura kräver excitation med UV-ljus och eftersom det är nödvändigt att ta två bilder för varje kvot. För data som erhållits med enda våglängd, synligt färgämnen ljus, normalisering av fluorescensintensiteten till stor del kompenserar för skillnaden i färg lastning mellan cellerna, men inte för färgen distribution inom en enskild cell, och detta måste beaktas. Även enda våglängd färgämnen kan i princip, kalibreras, är noggrannheten av tekniken fattiga och vi inte försöka göra detta.
Medan förhållandet mellan data som erhållits med Fura-2 (eller utsläpp förhållandet färg Indo), även utan kalibrering, ge ett acceptabelt trogen återgivning av relativa förändringar i [Ca 2 +] i, är fluorescensintensiteten den enda våglängd färgämnen långt ifrån linjärt relaterade till [Ca2 +] i. Under den mest användbara delen av mättnad kurvan förhållandet för enstaka våglängd färgämnen approximerar oftast logaritmisk. Vi använder för närvarande Oregon Grön BAPTA-1 (Figur 4) eftersom den är känslig för små förändringar i [Ca 2 +] i nära vila nivå s (50-100 nM). När [Ca2 +] Jag stiger över en mikroM svar kommer att underrepresenterade när det gäller fluorescens förändring och färgen kan mätta. Ett alternativ för förbättringar av tekniken utan att använda UV-excitation är att fördubbla lastceller med ett färgämne som Fluo-3 och Fura rött. Båda kan exciteras vid 488 nm men samtidigt deras svar är mycket olika. Registrering av utsläppsrätter på 540 och 650 nm ger ett förhållande som kan ge en bättre metod för noggrann övervakning av [Ca2 +] i (Haughland, 2002) och kan tillämpas på sperma (Nisigaki et al, 2006).
Figur 4. Förhållandet mellan fri [Ca 2 +] (nm) och fluorescens utsläpp på topp våglängd (ca 525 nm) för Oregon Grön BAPTA-1 och Oregon Grön BAPTA-2. OGB1 ger en högre fluorescens vid vila [Ca 2 +] men mättar på lägre nivåer och har därmed ett mindre användbar sortiment. Data för dessa tomter erhölls från molekylära sonder handbok (Haughland, 2002).
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av Wellcome Trust, Medicinska forskningsrådet, The Royal Society, Birmingham Science City och infertilitet Research Trust. Vi skulle vilja erkänna experthjälp av Cairn Forskning bygga och integrera avbildning riggar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low light level Camera | QImaging | Rolera XR | |
| Oregon Green BAPTA-1 | Invitrogen | 06807 | |
| Imaging Software | Andor | IQ | |
| Imaging Software | National Institutes of Health | Image J | Public domain software |
| LED illumination system | Cairn Research | Opto LED | |
| Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) | Invitrogen | P3000MP |
References
- Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).
- Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging. Biotechniques. 41, 191-197 (2006).
