Summary
这个视频演示从后期果蝇蛹大脑中的主要神经文化的准备。生活文化的视图显示突起生长的钙水平使用FURA - 2和成像。
Abstract
在这段视频中，我们展示了从后期果蝇蛹大脑中的主要神经文化的准备。程序开始在70-78小时puparium形成后，从动物的大脑去除。木瓜蛋白酶，在无血清生长介质中的几个洗短暂的潜伏期后孤立的大脑。在盖玻片上一个媒体下降5 UL每个大脑的机械分离的过程说明。在解离附近的SOMA的有丝分裂后神经元的轴突和树突sheered但神经细胞开始再生电镀的几个小时内进程。图像显示，在2天的现场文化。神经元继续阐述在第一周在文化进程。使用GAL4线驱动组织特异性表达GFP或RFP，如荧光标记，可以识别特定的神经元的人口文化。全细胞记录已经证明，培养的神经元形成胆碱能和GABA能突触的功能，自发主动。一个简短的视频段说明使用FURA - 2作为钙指示剂监测自发性钙瞬变和一碟培养的神经元的尼古丁诱发的钙反应的培养神经元的钙动态。这些蛹脑文化是一个有用的模型系统，在其中的遗传和药理工具可以被用来确定中央突触的形成和功能的内在和外在因素影响。
Protocol
培养前一天的准备工作：
- 设为无菌解剖解决方案。
- 使无菌DMEM培养液，并保持在4 ° 10毫升分装在2个星期。
- 在1个月的50或100μL分装无菌DDM2补充和冻结。
- 使错那县/层粘连蛋白。
- 大衣盖玻片。
可选：请无菌中国建材和存储长达4个月的冻结。
在培养一天
一，准备在层流罩酶解决方案（ES）
- 把解剖解决方案（DS）在15 mL离心管5毫升。
- 称取0.8毫克的L -半胱氨酸在0.6毫升的Eppendorf，加入150μL的DS。移液器向上和向下，直到晶体都不见了。
- DS /半胱氨酸的5毫升的DS加入150毫升拌匀。
- 添加木瓜蛋白酶50 U（单位）。
- 新增7毫升达到0.1 N娜OH拌匀。解决方案将在30分钟内清除。当被激活。
- 0.2毫米，进入无菌1.5毫升螺旋盖离心管注射器过滤器的过滤器酶液
木瓜蛋白酶：想要在5毫升的DS 50 ü。每个批次略有不同，所以必须计算多少：
37.3 mg / ml和28.3 U /毫克
37.3 x 28.3 = 1055.59单位/毫升（1000毫升）
50 U = 47.4毫升
二。请DDM2媒体
天的培养：添加下面的补充，使DDM2
到10毫升的DMEM添加补充，只是前培养：
- 100μL转
- 100μL腐胺
- 100μL硒
- 100μL孕酮
- 50μL胰岛素
- 加入10μl20 - 羟基
注 ：所有计划中的文化（镀在一个单独的35毫米培养皿盖玻片，1.5毫秒/文化媒体每个大脑足够DDM2）
步骤III - VI族可以在完成非无菌实验室工作台上，并应在45分钟或更少完成。
三。蛹收集
- 在解剖显微镜下选择10-15小瓶双方蛹。
- 将蛹干35毫米培养皿的盖子。
注 ：从蛹之间，我们一般使用55-78小时后puparium形成（APF）的大脑。它是从蛹年轻的脑解剖稍硬因为头部胶囊趋向崩溃，而突起生长的整体水平，是从最古老的蛹略有下降。在广- S的野生型菌株，这些阶段是公认的色素浅棕色，略微泛红的眼睛，其他地方很少颜料。
四。斩首显微镜下解剖
- 将两滴无菌解剖的解决方案，在培养皿的盖子，旁边以蛹。
- 用细镊子轻轻握住一个单一的蛹在左手和使用一个27号注射器针头，右手1毫升注射器在蛹前结束的角质层去除。
- 稍微挤压蛹钳和头部出现，使用27号针头割断颈部。
- 针或镊子尖，传输头下降解剖的解决方案。
- 重复，直到你在一个下降10-15头。
五，去除头部的大脑解剖显微镜下
- 每手举行了27号针头的1毫升注射器。
- 使用这些位置在下降解剖的解决方案，所以长鼻是面对你和背水面的头部是北飞头。
- 插入的长鼻留针针头部向下，使用权的针，右眼，从腹，背水面缝。
- 附近地区的长鼻左侧插入正确的针，然后用留针，轻轻地抑制角质层比左眼，右眼缝推向大脑。大脑应该出现在右边的狭缝，相对完整的，经常与两个光纤LOBES仍然附着，有时色素眼组织以及。
- 针转移到了一个新的无菌，35毫米培养皿无菌解剖生理盐水下降回推到大脑。
- 收集各基因型10-15脑筋。
六。视叶和酶处理去除
- 在每手按住1毫升注射器和27号针头与使用这些收集所有的大脑在一个小面积下降解剖解决方案
- 作为切削工具删除从每个大脑视叶，使组织文化其余是中央的大脑区域，使用注射器。
- 使用20 pipetmanμL，5μL，所有的大脑的一个单一的基因型转移到Eppendorf管中含有1毫升的无菌木瓜溶液。
- 大脑中的木瓜蛋白酶孵育10-15分钟在60 RPM的肩设置。
- 离心3分钟3000转。
其余的步骤在层流罩内应该做的无菌层流罩 - 所有的地方组织暴露于空气中的步骤。
七。洗涤
- 取出酶液，用无菌解剖液更换。
- 离心3分钟3000转。
- 用无菌解剖液洗一次，共3次。
- 删除解剖生理盐水取代DDM2。
- 离心机和洗共2次与DDM2。
- 大脑和媒体传输到无菌的35毫米培养皿。
八。解剖显微镜下Trituration和电镀
- 在盖玻片的中心广场5 DDM2 UL。
- 1脑转移，这有一个黄色的提示DDM2下降。
- 在显微镜下，使用27表针骰子成小块（应<1分钟）的大脑。
- 视觉引导下，打破玻璃吸管已使大块可以轻轻吸成吸管的尖端，并驱逐到中期回拉至一个细点的提示。我们用口吸痰管，来与100μL的血细胞比容毛细管玻璃标准。
注意 ：小心不要让媒体的气泡，您将需要凭经验确定使用的最佳尺寸吸管。好的，让你的大脑在大约30秒/脑，游离于一些单个细胞，仍有一些大团块。当你看看这些在更高的功率，大约有10-20％的神经元仍然有剩下的一些过程，仍然会有一些大的团块。如果游离于太多，那么所有的细胞是圆形的，他们将有这么多的持续损害，他们将无法生存。这一步需要实践和必须迅速完成，因为有一个大的表面体积比和DDM2下降的渗透压和pH值，可以迅速改变。组织需要尽快置于二氧化碳培养箱。 - 写在培养皿的盖子：“基因型，日期和时间”。
- 把35毫米100毫米培养皿培养皿（湿kimwipe）和30分钟，让在CO 2培养箱解决。
- 洪水1.5毫升DDM2的35毫米菜。
- 保持在5％ 二氧化碳培养箱（23℃）孵化器的文化。
注意 ：如果你没有访问到冷却的CO 2培养箱，使用标准的哺乳动物组织培养的孵化器，要么把它在一个凉爽的房间和热至23 ° C，或在实验室中，临时关闭，并使用在孵化器底部的冰盘来调节周围环境温度。
九。喂养细胞
- 在第1天（第二天），加入0.5毫升的CNBM/B27（条件培养基），使3:1 DDM2：CNBM/B27。
- 第5天更换为3:1 DDM2 1毫升的媒体：CNBM/B27。
- 保持在3:1 DDM2与喂养细胞：CNBM/B27，每4-5天。
注 ：文化可非神经元的空调媒体没有增长，但神经元未免显得更加脆弱，更难以在电生理学实验中使用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
收获胚胎/产后的啮齿类动物的大脑的神经细胞可以生长在原代细胞培养，他们延长突起，形成功能性突触连接。这些文化的编制方法是建立在啮齿类动物的神经元文化的研究起到了关键作用，在确定基因和环境因素参与调节突触的形成和功能的银行家和Goslin，（1991）。虽然从各种不同的物种昆虫的神经元也可以培养，从果蝇（Rohrbough等，2003）所示，形成文化功能的突触连接的唯一的昆虫神经元。神经母细胞收获中旬，原肠胚阶段果蝇胚胎生长在定义的媒体引起神经元的电兴奋和表格功能，interneuronal突触连接（奥多德，1995年，李和奥多德，1999年）。要识别已知在调解成人的行为，我们开发的视频后期果蝇（苏和奥多德，2003年）的大脑在这收获和培养神经元的说明技术所涉及的神经元突触的形成和功能调节的因素。此过程的主要特点之一是使用的木瓜蛋白酶，而不是胶原酶或准备昆虫神经文化传统等恶劣酶，。木瓜蛋白酶的结果，在保留短轴突的进程，生存的分离神经元再生神经炎的进程，并形成功能interneuronal突触连接。全录音，在确定的细胞群，包括蘑菇体凯尼恩细胞介导快速兴奋性突触传递的文化是由nAChRs而抑制GABA受体介导（苏和奥多德，2003年）。我们最近的电子显微镜分析表明，与在成人大脑化学和电突触（Oh等人，2007年）类似的结构特点中的神经元在文化形成突触。如视频所示，文化也适合FURA - 2钙成像研究，我们已经使用了这些调查底层自发和诱发的变化在确定的细胞群，包括凯尼恩细胞和胆碱能神经元（江等的细胞内钙水平的细胞机制人，2005年Campusano等，2007）。有了这种文化系统在果蝇中进行了广泛的遗传工具包提供了一个非常有用的工具，确定中央突触的结构，功能和可塑性的内在和外在的监管。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院授予NS27501 DKOD支持。授予加州大学欧文分校在霍华德休斯医学研究所教授计划通过DKOD支持这项工作提供了额外的支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C-2010 | To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months. | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months. | |
| Coverslips | Bellco Glass | 1943-00012 | 12 mm glass coverslips | |
| ConA + Laminin solution | Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month. | |||
| Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C. | ||
| Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C. | ||
| Solution B: HEPES | Buffer | Sigma-Aldrich | H-3375 | 20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C. |
| Solution A | Buffer | For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C. | ||
| Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month. | ||||
References
- Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Su, H., O'Dowd, D. K. Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors. J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).
- Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells. Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).
- Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture. Develop Neurobiol. , (2007).
