Cultivos neuronales primarios del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía

Summary

Este video muestra la preparación de cultivos primarios de neuronas del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía. Puntos de vista de las culturas show en vivo de crecimiento de las neuritas y la imagen de los niveles de calcio con Fura-2.

Abstract

En este vídeo, se demuestra la preparación de cultivos primarios de neuronas del cerebro de Drosophila finales de etapa de pupas. El procedimiento comienza con la eliminación de los cerebros de los animales en 70-78 horas después de la formación pupario. Los cerebros aislados se presentan después de la incubación breve en papaína seguido de varios lavados en medio de cultivo libre de suero. El proceso de separación mecánica de cada cerebro en una caída de 5 ul de los medios de comunicación en un cubreobjetos se ilustra. Los axones y las dendritas de las neuronas post-mitóticas son sheered cuando esté cerca del soma en la disociación, pero las neuronas comienzan a regenerarse los procesos dentro de unas horas de la siembra. Las imágenes muestran las culturas en vivo en 2 días. Las neuronas continúan elaborando los procesos durante la primera semana de la cultura. Poblaciones neuronales específicas, se pueden identificar en la cultura de uso de líneas GAL4 para dirigir la expresión específica de tejido de los marcadores fluorescentes, como las buenas prácticas agrarias o RFP. Grabaciones de células enteras han demostrado los cultivos de neuronas forman sinapsis funcionales, colinérgicas y GABAérgicas espontáneamente activo. Un segmento corto video ilustra la dinámica del calcio en las neuronas cultivadas con Fura-2 como un tinte indicador de calcio para controlar los transitorios espontánea de calcio y la nicotina respuestas evocadas de calcio en un plato de neuronas cultivadas. Estas culturas el cerebro de pupa son un modelo útil en el que las herramientas genéticas y farmacológicas se puede utilizar para identificar los factores intrínsecos y extrínsecos que influyen en la formación y función de las sinapsis centrales.

Protocol

Los preparativos antes del día de cultivo:

1. Hacer una solución estéril de disección.
2. Hacer estéril DMEM y mantenerse en alícuotas de 10 ml a 4 º C durante 2 semanas.
3. Hacer estéril DDM2 suplementos y congelar en 50 o 100 alícuotas de 1 mes.
4. Hacer ConA / laminina.
5. Cubreobjetos de abrigo.
   Opcional: Haga CNBM estéril y guardar congelado hasta por 4 meses.

En el día de cultivo

I. Preparar la solución de la enzima (ES) en la campana de flujo laminar

1. Poner 5 ml de solución de disección (DS) en un tubo de centrífuga de 15 ml.
2. Pesar 0,8 mg de L-cisteína en un eppendorf de 0,6 ml y añadir 150 ml de DS. Pipeta hacia arriba y abajo hasta que los cristales se han ido.
3. Añadir 150 ml de DS / cisteína al 5 DS ml y mezclar bien.
4. Añadir 50 U (unidades) de la papaína.
5. 7 ml de 0,1 N de Na OH y mezclar bien. Solución clara a los 30 minutos. cuando se activa.
6. Solución de la enzima de filtro con filtro de 0,2 mm en una jeringa estéril de 1,5 ml tubo de microcentrífuga tapa rosca
   
   Papaína: ¿Quieres 50 U en 5 ml DS. Cada lote es un poco diferente, por lo que debe calcular la cantidad de:
   37,3 mg / ml y 28,3 U / mg
   37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml)
   50 U = 47,4 ml
   

II. Hacer DDM2 medios

En el día de cultivo: añadir los siguientes complementos para hacer DDM2

A 10 ml de DMEM añadir los suplementos, justo antes de cultivo:

1. 100μl de transferrina
2. 100μl putrescina
3. 100μl selenio
4. La progesterona 100μl
5. La insulina 50μl
6. 10μl de 20 Hydroxyecdysone

Nota: Asegúrese DDM2 suficiente para todas las culturas planificadas (cada cerebro colocadas en un portaobjetos simple en un individuo de 35 mm placa de Petri, 1,5 m de los medios de comunicación / cultura)

Paso III-VI puede estar en una mesa de laboratorio hecho estéril y debe ser completado en 45 minutos o menos.

III. Pupas Colección

1. Seleccione 10-15 pupas de los lados del vial con un microscopio de disección.
2. Lugar pupas en la tapa de una seca de 35 mm placa de Petri.

Nota: Por lo general, utilizan los cerebros de las pupas entre 55-78 horas después de la formación de pupa (APF). Es un poco más difícil de diseccionar el cerebro de las pupas jóvenes ya que las cápsulas cefálicas y tienden a colapsarse, mientras que el nivel general de crecimiento de las neuritas es ligeramente más baja desde el más antiguo pupas. En la cepa de tipo salvaje Cantón-S, estas etapas son reconocidos por los ojos pigmentados que son de color marrón claro a rojizo poco, con poco pigmento en otros lugares.

IV. Decapitación bajo microscopio de disección

1. Coloque dos gotas de solución estéril de disección en la tapa de la placa de Petri, junto a las pupas.
2. Aplique suavemente una sola pupa con unas pinzas finas en la mano izquierda y el uso de una aguja de calibre 27 jeringa conectada a una jeringa de 1 cc en la mano derecha para eliminar la cutícula en el extremo anterior de la pupa.
3. Apriete pupa poco con pinzas, y como cabeza emerge uso aguja de calibre 27 para cortar el cuello.
4. Con la punta de la aguja o con pinzas, la transferencia de la cabeza a la caída de la disección de una solución.
5. Repita hasta que haya 10-15 cabezas en una sola gota.

V. Eliminación del cerebro de la cabeza bajo el microscopio de disección

1. En cada mano, mantener una jeringa de 1 cc con una aguja de calibre 27.
2. Utilice estos a la posición de la cabeza de mosca en la caída de la disección de una solución para la probóscide es hacia arriba y la superficie dorsal de la cabeza es el norte.
3. Inserte la aguja a la izquierda en la trompa de echar la cabeza hacia abajo y el uso de la aguja derecha para hacer una raja en el ojo derecho, que va desde el ventral a la superficie dorsal.
4. Insertar la aguja justo al lado de la izquierda en la región de la trompa y luego usar la aguja izquierda para presionar suavemente la cutícula sobre el ojo izquierdo, empujando el cerebro hacia el corte en el ojo derecho. El cerebro debe surgir de la ranura de la derecha, relativamente intacto, a menudo con ambos he ópticabes aún está unido y en ocasiones el tejido ocular pigmentado así.
5. Empuje el cerebro en la parte posterior de la aguja y la transferencia de una gota de solución salina estéril de disección en un nuevo plato de estériles de 35 mm de Petri.
6. Recoger 10-15 cerebro para cada genotipo.
   

VI. Eliminación de los lóbulos ópticos y tratamiento enzimático

1. En cada mano, mantener una jeringa de 1 cc con una aguja de calibre 27 y usarlas para recopilar todos los cerebros en una pequeña área de la gota de la solución de disección
2. Use jeringas, herramientas de corte para eliminar los lóbulos ópticos de cada cerebro para el resto del tejido de la cultura es la región del cerebro.
3. Use un Pipetman 20 l, del 5 l, para transferir todos los cerebros de un solo genotipo a un tubo eppendorf con 1 ml de solución de papaína estéril.
4. Los cerebros se incubaron en la papaína durante 10-15 minutos en un conjunto rotatorio a 60 rpm.
5. Centrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos.
   

Dentro de campana estéril de flujo laminar - todas las medidas que el tejido es expuesto al aire se debe hacer en campana de flujo laminar para el resto de pasos.

VII. Lavado

1. Eliminar la solución de la enzima y reemplazar con una solución estéril de disección.
2. Centrifugar a 3000 rpm durante 3 minutos.
3. Lavar con una solución estéril de la disección de un total de 3 veces.
4. Quitar y reemplazar la disección de solución salina con DDM2.
5. Centrifugar y lavar con un total de 2 veces con DDM2.
6. La transferencia de los cerebros y los medios de comunicación a una estéril de 35 mm placa de Petri.
   

VIII. Trituración y de las planchas bajo microscopio de disección

1. Lugar 5 ul de DDM2 en el centro de un cubreobjetos.
2. La transferencia de un cerebro a esta caída de DDM2 con una punta amarilla.
3. Bajo el microscopio, el uso de agujas de calibre 27 dados hasta el cerebro en pedazos pequeños (se debe tomar <1 minuto).
4. Bajo la guía visual, rompa la punta de una pipeta de vidrio que ha sido puesto a un punto fino para que las piezas más grandes pueden ser absorbidos por el cuidado extremo de la pipeta y expulsados ​​de nuevo en el medio. Usamos tubos de boca de succión que vienen de serie con 100 l de vidrio de hematocrito capilar.
   
   Nota: Tenga cuidado de no tener burbujas en los medios de comunicación y que tendrá que determinar empíricamente la pipeta de mejor tamaño para su uso. Los buenos le permiten disociar el cerebro con algunas células individuales y aún así algunos grandes grupos, en unos 30 segundos / cerebro. Cuando se mira a estos a una potencia mayor, aproximadamente el 10-20% de las neuronas todavía debe tener algunos procesos pendientes y todavía habrá algunos grandes grupos. Si se disocian demasiado, entonces todas las células se ronda y ellos han sufrido tanto daño que no va a sobrevivir. Este paso requiere práctica y debe hacerse rápidamente, ya que hay una gran superficie-a-volumen y la osmolalidad y el pH de la caída de DDM2 pueden cambiar rápidamente. Tejido tiene que ser colocado en incubadora de CO ₂ tan pronto como sea posible.
   
   
5. Escribir en la tapa de la placa de Petri: "genotipo, fecha y hora".
6. Coloque la placa de Petri de 35 mm en una placa de Petri de 100 mm (con Kimwipe húmedo) y dejar reposar en la incubadora de CO ₂ durante 30 minutos.
7. Inundar el plato de 35 mm con 1,5 ml de DDM2.
8. Mantenga las culturas en la incubadora en un 5% incubadora de CO ₂ (23 ° C).
   
   Nota: Si usted no tiene acceso a un enfriamiento incubadora de CO _2, utilizar un estándar de cultivo de tejidos de mamíferos incubadora y, o bien ponerlo en un cuarto frío y el calor a 23 ° C, o poner en el laboratorio, cierre temporal, y el uso de hielo en una bandeja en la parte inferior de la incubadora para regular temperatura ambiente alrededor.
   

IX. Las células de alimentación

1. El día 1 (día siguiente), añadir 0,5 ml de CNBM/B27 (Media acondicionado) para hacer DDM2 03:01: CNBM/B27.
2. El día 5 reemplazar 1 ml de los medios de 3:01 DDM2: CNBM/B27.
3. Mantener las células de alimentación con 3:01 DDM2: CNBM/B27 cada 4-5 días.
   
   Nota: Los cultivos pueden crecer sin los medios de comunicación acondicionado no neuronales, pero las neuronas parecen un poco más frágil y son más difíciles para su uso en experimentos de electrofisiología.

Discussion

Las neuronas cosecha de los cerebros de los roedores embrionarias / postnatal se puede cultivar en cultivo de células primarias, donde se extienden neuritas y la forma funcional de conexiones sinápticas. Métodos para la preparación de estas culturas están bien establecidos y los estudios en cultivos de neuronas de roedores han jugado un papel fundamental en la identificación de genes y factores ambientales implicados en la regulación de la formación de sinapsis y la función (Banker y Goslin, 1991). Mientras que las neuronas de insectos de una variedad de especies también se pueden cultivar en la cultura, las neuronas de los insectos sólo se muestra a la forma funcional de conexiones sinápticas en la cultura son de Drosophila (Rohrbough et al, 2003). Neuroblastos cosechado a mediados de gástrula embriones de Drosophila crecido en los medios de comunicación se define dar lugar a neuronas que son eléctricamente excitables y formar conexiones funcionales interneuronales sinápticas (O'Dowd, 1995; Lee y O'Dowd, 1999). Para identificar los factores que regulan la forma y la función sináptica de las neuronas se sabe están involucrados en la mediación de comportamientos adultos que desarrolló la técnica se muestra en este video de la cosecha y el cultivo de neuronas de los cerebros de la etapa tardía de Drosophila (Su y O'Dowd, 2003). Una de las características clave de este procedimiento fue utilizar la papaína, en lugar de la colagenasa y otras enzimas duras tradicionalmente utilizados en la preparación de insectos, cultivos neuronales. Resultados de la papaína en las neuronas disociadas de retención corto axones que sobreviven, los procesos de regeneración neuríticas, y la forma funcional de conexiones sinápticas interneuronales. Grabaciones de todo en las poblaciones de células identificadas, incluyendo hongos del cuerpo las células Kenyon, muestran que la rápida transmisión sináptica excitatoria en la cultura está mediada por nAChRs mientras que la inhibición es mediada por los receptores GABA (Su y O'Dowd, 2003). Nuestros últimos análisis de microscopia electrónica demuestra que las neuronas en las sinapsis forma la cultura con características estructurales que son similares a los químicos y las sinapsis eléctricas en el cerebro adulto (Oh et al., 2007). Como se muestra en el video, las culturas también son susceptibles de Fura-2 estudios de imágenes de calcio y hemos utilizado estos para investigar los mecanismos celulares subyacentes espontáneo y provocado cambios en los niveles de calcio intracelular en las poblaciones de células identificadas como células de Kenyon y las neuronas colinérgicas (Jiang et al, 2005;. Campusano et al, 2007).. Con el kit de herramienta de amplia genéticos disponibles en Drosophila este sistema de cultivo es una herramienta muy útil para la identificación de los reguladores intrínsecos y extrínsecos de la estructura de la sinapsis central, función y plasticidad.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Concanavalin A		Sigma-Aldrich	C-2010	To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020	Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Glass	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma-Aldrich	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.