Cultures neuronales primaires du cerveau des drosophiles stade tardif pupes

Summary

Cette vidéo montre la préparation de cultures primaires de neurones du cerveau des drosophiles stade avancé pupes. Vues des cultures vivantes montrent neurites et l'imagerie des niveaux de calcium en utilisant Fura-2.

Abstract

Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation des cultures primaires de neurones du cerveau des drosophiles stade avancé pupes. La procédure commence par l'enlèvement des cerveaux des animaux à 70-78 heures après la formation puparium. Les cerveaux isolés sont présentés après une brève incubation de la papaïne suivie de plusieurs lavages en milieu de croissance sans sérum. Le processus de dissociation mécanique de chaque cerveau dans une baisse de 5 ul des médias sur une lamelle est illustré. Les axones et des dendrites des neurones post-mitotiques sont fait une embardée hors près du soma au cours de dissociation, mais les neurones commencent à se régénérer les processus au sein de quelques heures de placage. Les images montrent des cultures vivantes moins 2 jours. Neurones continuer à élaborer des processus pendant la première semaine de la culture. Populations neuronales spécifiques peuvent être identifiées en culture en utilisant GAL4 lignes pour conduire l'expression tissu spécifique de marqueurs fluorescents tels que la GFP ou DP. Enregistrements de cellules entières ont démontré les neurones cultivés forme fonctionnelle, spontanément actifs synapses cholinergiques et GABAergiques. Un segment courte vidéo illustre la dynamique du calcium dans les neurones cultivés en utilisant Fura-2 comme un colorant indicateur de calcium pour contrôler transitoires calciques spontanées et la nicotine réponses de calcium évoquée dans un plat de neurones en culture. Ces cultures du cerveau pupe sont un système modèle utile dans lesquels des outils génétiques et pharmacologiques peuvent être utilisés pour identifier les facteurs intrinsèques et extrinsèques qui influencent la formation et la fonction des synapses centrales.

Protocol

Les préparatifs avant le jour de la culture:

1. Faire une solution stérile de dissection.
2. Faire stériles DMEM et garder en aliquotes de 10 ml à 4 ° C pendant 2 semaines.
3. Faire stériles DDM2 suppléments et geler en 50 ou 100 aliquotes pendant 1 mois.
4. Faire ConA / laminine.
5. Manteau lamelles.
   Optionnel: Faire CNBM stériles et conserver au congélateur jusqu'à quatre mois.

Le jour de la culture

I. Préparer la solution enzymatique (ES) en hotte à flux laminaire

1. Mettre 5 ml de solution de dissection (DS) dans un tube à centrifuger de 15 ml.
2. Peser à 0,8 mg de L-cystéine dans un eppendorf de 0,6 ml et ajouter 150 ul de la DS. Pipeter haut en bas jusqu'à cristaux ont disparu.
3. Ajouter 150 ml de DS / cystéine dans les 5 ml DS et bien mélanger.
4. Ajouter 50 U (unités) de la papaïne.
5. Ajouter 7 ml de 0,1 N Na OH et bien mélanger. Solution sera clair dans les 30 min. lorsqu'il est activé.
6. Solution enzymatique filtre avec filtre seringue 0,2 mm dans un tube de 1,5 à vis stériles ml microcentrifugeuse bouchon
   
   Papaïne: Voulez-vous 50 U dans DS 5 ml. Chaque lot est légèrement différente, donc faut calculer combien:
   37,3 mg / ml et 28,3 U / mg
   37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml)
   50 U = 47,4 ml
   

II. Faire DDM2 des médias

Le jour de la culture: ajouter les suppléments suivants pour faire DDM2

A 10 ml de DMEM ajouter les suppléments, juste avant la culture:

1. 100 ul de la transferrine
2. 100 ul Putrescine
3. 100 ul Sélénium
4. La progestérone 100 ul
5. Insuline 50 pl
6. 10 ul 20 Hydroxyecdysone

Remarque: Assurez assez DDM2 pour toutes les cultures prévues (chaque cerveau plaqué sur une lamelle unique dans un plat individuel de 35 mm de Pétri, 1,5 ms de média / culture)

Etape III-VI peut être à une table de laboratoire non stériles fait et devrait être terminé en 45 minutes ou moins.

III. Les chrysalides Collection

1. Sélectionnez 10-15 pupes des côtés du flacon sous un microscope à dissection.
2. Pupes place dans le couvercle d'une boîte de Pétri de 35 mm à sec.

Note: Nous utilisons généralement le cerveau à partir de pupes entre 55-78 heures après la formation puparium (CSA). Il est légèrement plus difficile à disséquer le cerveau de la jeune nymphe depuis le capsules céphaliques ont tendance à s'effondrer, tandis que le niveau global de la croissance des neurites est légèrement inférieure de la plus ancienne des pupes. Dans la souche Canton-S de type sauvage, ces étapes sont reconnus par les yeux qui sont pigmentées brun clair à légèrement rougeâtre, avec des pigments peu ailleurs.

IV. Décapitation au microscope disséquant

1. Placez deux gouttes de solution de dissection stériles dans le couvercle de la boîte de Pétri, à côté de pupes.
2. Maintenez une seule nymphe avec une pince fine dans la main gauche et l'utilisation d'une aiguille de calibre 27 seringue fixée à une seringue de 1 cc dans la main droite pour enlever la cuticule à l'extrémité antérieure de la chrysalide.
3. Presser légèrement avec une pince nymphe et en tant que tête émerge utilisez une aiguille de calibre 27 pour couper le cou.
4. Avec la pointe de l'aiguille ou la pince, le transfert à la tête goutte de dissection solution.
5. Répétez jusqu'à ce que vous avez de 10 à 15 têtes dans une seule goutte.

Retrait V. le cerveau de la tête sous loupe binoculaire

1. Dans chaque main tenir une seringue de 1 cc avec une aiguille de calibre 27.
2. Utilisez-les pour positionner la tête de volée dans la goutte de dissection solution si la trompe est tournée vers vous et la surface dorsale de la tête est au nord.
3. Insérez l'aiguille à gauche dans la trompe à la broche de la tête en bas et utilisez l'aiguille de droite pour faire une fente dans l'œil droit qui va de la ventrale à la surface dorsale.
4. Insérez l'aiguille droite près de la gauche dans la région de la trompe, puis utilisez l'aiguille de gauche à enfoncer délicatement la cuticule sur l'oeil gauche, pousser le cerveau vers la fente de l'oeil droit. Le cerveau doit sortir de la fente sur la droite, relativement intacte, souvent avec deux optiques lobes encore attaché et parfois les tissus oculaires pigmentés ainsi.
5. Poussez le cerveau sur le dos de l'aiguille et le transfert d'une goutte de solution saline stérile dans la dissection d'un nouveau stérile, plat de 35 mm de Pétri.
6. Recueillir 10-15 cerveaux pour chaque génotype.
   

VI. Suppression des lobes optiques et un traitement enzymatique

1. Dans chaque main tenir une seringue de 1 cc avec une aiguille de calibre 27 et de les employer pour recueillir tous les cerveaux dans une petite zone de la goutte de solution de dissection
2. Utiliser des seringues que les outils de coupe pour enlever les lobes optiques de chaque cerveau de sorte que le tissu restant de la culture est la région du cerveau central.
3. Utilisez un Pipetman 20 pl, fixé à 5 pl, pour transférer tous les cerveaux d'un génotype unique à un tube Eppendorf contenant 1 ml de solution de papaïne stérile.
4. Cerveaux incubés dans la papaïne pendant 10-15 minutes sur un rotateur réglé à 60 rpm.
5. Centrifuger à 3000 rpm pendant 3 minutes.
   

A l'intérieur capuche à flux laminaire stérile - toutes les étapes où le tissu est exposé à l'air doit être fait dans une hotte à flux laminaire pour les étapes restantes.

VII. Lavage

1. Retirer et remplacer la solution d'enzyme avec une solution stérile de dissection.
2. Centrifuger à 3000 rpm pendant 3 minutes.
3. Laver avec une solution stérile de disséquer un total de 3 fois.
4. Retirer salines dissection et la remplacer par DDM2.
5. Centrifuger et laver un total de 2 fois avec DDM2.
6. Transfert des cerveaux et des médias dans un plat stériles de 35 mm de Pétri.
   

VIII. Trituration et de placage sous loupe binoculaire

1. Placer 5 ul d'DDM2 dans le centre d'une lamelle.
2. Transférer 1 cerveau pour cette goutte d'DDM2 avec une pointe de jaune.
3. Sous le microscope, l'utilisation d'aiguilles de calibre 27 à la place du cerveau dés en petits morceaux (devrait prendre <1 minute).
4. Sous guidage visuel, casser la pointe d'une pipette en verre qui a été tirée en une fine pointe de sorte que les plus gros morceaux peuvent être doucement aspiré dans la pointe de la pipette et expulsés de nouveau dans le milieu. Nous utilisons des tubes d'aspiration bouche qui sont livrés en standard avec 100 ul de verre hématocrite capillaire.
   
   Remarque: Prenez soin de ne pas obtenir des bulles dans les médias et vous aurez besoin de déterminer empiriquement la pipette meilleure taille à utiliser. Les bons vous permettent de dissocier le cerveau avec des cellules individuelles et encore quelques grosses touffes, en environ 30 secondes / cerveau. Lorsque vous regardez ces à haute puissance, environ 10-20% des neurones devrait encore avoir quelques procédés restants et il y aura encore quelques grosses touffes. Si vous dissocier trop, alors toutes les cellules seront rondes et ils ont subi des dommages tant qu'ils ne seront pas survivre. Cette étape nécessite de la pratique et doit être fait rapidement car il ya une grande surface à volume élevé et de l'osmolalité et le pH de la goutte d'DDM2 peuvent changer rapidement. Tissus doit être placé dans incubateur à CO ₂ aussi vite que possible.
   
   
5. Écrire sur le couvercle boîte de Pétri: «génotype, la date et l'heure".
6. Mettez la boîte de Petri de 35 mm dans un plat de Pétri de 100 mm (avec Kimwipe humide) et laissez s'installer dans l'incubateur CO ₂ pendant 30 min.
7. Recouvrir le plat de 35 mm avec 1,5 ml de DDM2.
8. Gardez les cultures dans l'incubateur à 5% de CO ₂ incubateur (23 ° C).
   
   Remarque: Si vous n'avez pas accès à un refroidissement incubateur à CO _2, utiliser une norme de mammifères incubateur de culture tissulaire et soit le mettre dans une pièce fraîche et chauffer à 23 ° C, ou mis dans le laboratoire, éteignez temp, et l'utilisation glace dans un bac en bas de l'incubateur pour réguler température ambiante autour.
   

IX. Cellules nourricières

1. Le Jour 1 (le lendemain), ajoutez 0,5 ml de CNBM/B27 (milieux conditionnés) de faire DDM2 03h01: CNBM/B27.
2. Le Jour 5 remplacer 1 ml de médias pour 03h01 DDM2: CNBM/B27.
3. Gardez les cellules d'alimentation avec 3:01 DDM2: CNBM/B27 tous les 4-5 jours.
   
   Note: Les cultures peuvent être cultivées sans que les médias non-neuronales conditionné mais les neurones apparaissent un peu plus fragiles et sont plus difficiles à utiliser dans des expériences d'électrophysiologie.

Discussion

Neurones récoltés à partir de cerveaux de rongeurs embryonnaire / postnatale peut être cultivé en culture cellulaire primaire, où elles s'étendent neurites et la forme fonctionnelle des connexions synaptiques. Méthodes de préparation de ces cultures sont bien établies et d'études dans les cultures neuronales de rongeurs ont joué un rôle crucial dans l'identification des gènes et des facteurs environnementaux impliqués dans la régulation de la formation des synapses et de la fonction (Banker et Goslin, 1991). Alors que les neurones d'insectes d'une variété d'espèces peuvent également être mises en culture, les neurones ne insectes montré à la forme fonctionnelle des connexions synaptiques dans la culture sont de la drosophile (Rohrbough et al, 2003). Neuroblastes récoltés mi-gastrula embryons de drosophile cultivées dans des milieux définis donnent lieu à des neurones qui sont électriquement excitables et la forme fonctionnelle, interneuronales connexions synaptiques (O'Dowd, 1995; Lee et O'Dowd, 1999). Pour identifier les facteurs qui régulent la forme et la fonction synaptique dans les neurones connus pour être impliqués dans la médiation de comportements adultes, nous avons développé la technique illustrée dans cette vidéo pour les neurones en culture de récolte et de la cervelle de la fin du stade de la drosophile (Su et O'Dowd, 2003). Une des principales caractéristiques de cette procédure était d'utiliser la papaïne, au lieu de la collagénase ou d'autres enzymes dures traditionnellement utilisées dans la préparation des cultures de neurones d'insectes. Résultats de la papaïne dans les neurones dissociés conservant courte processus axonaux qui survivent, régénérer les processus neuritique, et la forme fonctionnelle interneuronales connexions synaptiques. Enregistrements entiers de populations de cellules identifiées, y compris le corps des cellules de champignons Kenyon, montrent que la transmission synaptique excitatrice rapide dans les cultures est médiée par une inhibition nAChR tout est médiatisé récepteurs GABA (Su et O'Dowd, 2003). Nos récentes analyses au microscope électronique montre que les neurones forment des synapses dans la culture avec des caractéristiques structurelles qui sont semblables à la fois chimiques et les synapses électriques dans le cerveau adulte (Oh et al., 2007). Comme illustré dans la vidéo, les cultures sont également prêtent à Fura-2 études d'imagerie calcique et nous avons utilisé ces pour enquêter sur les mécanismes cellulaires qui sous-tendent les changements spontanés et évoqués dans les niveaux de calcium intracellulaire dans des populations cellulaires dont les cellules identifiées Kenyon et les neurones cholinergiques (Jiang et al, 2005;. Campusano et al, 2007).. Avec le kit outil génétique chez la drosophile vaste disponibles ce système de culture est un outil très utile pour identifier des régulateurs intrinsèques et extrinsèques de la structure de la synapse centrale, la fonction et la plasticité.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Concanavalin A		Sigma-Aldrich	C-2010	To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020	Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Glass	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma-Aldrich	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C.
Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month.