Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Анализ ДНК двухцепочечной Break (DSB) Ремонт в клетках млекопитающих

Published: September 8, 2010 doi: 10.3791/2002

Summary

В этой статье описывается GFP основе флуоресценции

Abstract

ДНК двухцепочечной разрывы самых опасных повреждений ДНК, что может привести к массовой гибели генетической информации и гибели клеток. Клетки ремонт ДР с использованием двух основных путей: негомологичных конце соединения (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HR). Возмущения NHEJ и HR часто связаны с преждевременным старением и опухолей, поэтому важно иметь количественный способ измерения каждого пути DSB ремонта. Наша лаборатория разработала флуоресцентный конструкций репортеру, что позволит чувствительной и количественного измерения NHEJ и HR. Конструкции на основе генной инженерии GFP содержащие сайты узнавания для редких резки I-SCEI эндонуклеазы для индукции ДР. Начиная конструкции GFP отрицательным, как ген GFP инактивируется дополнительные экзона, либо мутаций. Успешный ремонт I-SCEI вызванные перерывами на NHEJ или HR восстанавливает функциональный ген GFP. Число GFP-положительных клеток рассчитывали с помощью проточной цитометрии обеспечивает количественную меру NHEJ или HR-эффективности.

Protocol

В этом протоколе описываются метод анализа ДНК, ремонт DSB с хромосомным интегрированной репортер конструкций 1,2, где ДР индуцируются в естественных условиях на переходные выражения редких эндонуклеазы резки I-SCEI 3. Интегрированный анализ дает преимущество анализа DSB ремонт в течение хромосомных контексте. Однако, этот протокол требует длительного ячейки пассажи, которые могут быть проблематичным при работе с первичными ячейками.

Альтернативный подход состоит в анализе внехромосомными где репортер конструкций перевариваются в пробирке с I-SCEI или HindIII эндонуклеаз и затем трансфекции в клетки в виде линейных ДНК. Exctrachromosomal протокол анализа 4 аналогично интегрированный анализ описано ниже со следующими изменениями. Для анализа внехромосомными опустить интеграции репортер конструкций, а вместо этого совместно трансфекции клеток с 0,5 мкг NHEJ репортера плазмиды линеаризованной в пробирке с I-SCEI или HindIII и 0,1 мкг pDsRed2-N1, как трансфекции контроля. Для анализа HR совместной трансфекции 2 мкг HR репортера плазмиды линеаризованной с I-SCEI или HindIII и 0,1 мкг pDsRed2-N1. Анализ клеток FACS через три дня после трансфекции. Внехромосомными анализ позволяет анализ DSB ремонта в первичных изолятах, избегая обширные пассажи ячейки, а также содействие анализ нескольких клеточных линий.

1. Репортер Конструкции для NHEJ и HR

Кассета NHEJ репортер 5 содержит ген GFP с инженерии 3 кб интрон из гена Pem1 (GFP-Pem1). Pem1 интрон содержит аденовирусных экзона окружении распознавание последовательностей для HindIII и I-SCEI эндонуклеаз (рис. 1a) для индукции ДР. I-SCEI сайты в перевернутой ориентации. I-SCEI имеет nonpalindromic последовательность признание, следовательно, два перевернутой сайты генерировать несовместимы концы ДНК (рис. 1в). Несовместимые ДНК концы лучших имитируют естественные ДР. Нетронутой кассетой NHEJ является GFP отрицательным аденовирусных экзона нарушает GFP ORF. По индукции ДР М-SCEI, аденовирусной экзона удаляется и NHEJ восстанавливает функции гена GFP (рис. 2). Уникальная особенность этого репортера NHEJ в том, что она способна обнаруживать широкий спектр событий NHEJ с интрона может терпеть удаления и вставки.

Кассета HR репортер 1 (рис. 1, б) также основан на GFP-Pem1. В кассету HR, первый экзон из GFP-Pem1 содержит 22 б.п. удаление в сочетании с вставкой из трех сайтов рестрикции, I-SceI/HindIII/I-SceI. Удаление гарантирует, что GFP не может быть восстановлена ​​путем событие NHEJ. Два И-SCEI сайты в перевернутой ориентации, так что я-SCEI пищеварения листьев несовместимы концы (рис. 1в). Первый экземпляр GFP-Pem1 следуют promoter-less/ATG-less первых экзонов и интронов из GFP-Pem1. Нетронутым конструкция GFP-отрицательные. По индукции DSB М-SCEI пищеварения функциональный ген GFP восстанавливается внутримолекулярной или межмолекулярной генной конверсии между двумя копиями мутировавшего первый GFP-Pem1 экзонов. Со второй копии гена GFP отсутствует первый кодон ATG и второго экзона, пересекая или однонитевые отжига не восстановит GFP деятельности. Такая конструкция позволяет эксклюзивные выявления генной конверсии, который является преобладающим путем HR в клетках млекопитающих (рис. 3).

2. Интеграция Reporter Создает в геноме

  1. Сделать высоким качеством подготовки NHEJ или HR репортера плазмиды. Для достижения наилучших результатов используйте Qiagen Эндо бесплатно Kit. Мера плазмиды концентрации и чистоты на абсорбцию при 260/280 нм.
  2. Линеаризовать 10 мкг репортера плазмиды путем переваривания с 50 U из NheI в 50 мкл (общий объем реакции) в течение 6 часов в 37 ° C инкубатора (не используйте сухую блока, чтобы предотвратить испарение). Purify ДНК из раствора с пищеварением Qiagen QiaexII Kit, элюировать ДНК в 20 мкл 10 мМ Трис-HCl рН 8,0. Мера концентрации ДНК и чистоту поглощения при 260/280 нм. Как правило, вы потеряете 20-30% ДНК во время очистки. Подтверждение выхода и пищеварение, запустив небольшую аликвоту (2 мкл) на гель, наряду с непереваренной репортер конструкции. Очищенной линеаризованной построить репортер может храниться при температуре 20 ° C.
  3. В ходе подготовки к трансфекции, приносят клеткам лучших растущей состоянии. Если, начиная с замороженными флакон, разделение клетки дважды, прежде чем трансфекции. Если, начиная с пластиной вырожденных клеток, разделить их один раз.
  4. Расти клетки на 70-80% слияния (обычно двух дней, если покрытием 5х10 5 cells/100 мм пластины, для нормальных человеческих фибробластов). Это имеет решающее значение для лучшей эффективности трансфекции довести клеток в логарифмической роста. Активно растущие культуры содержит клетки в стадии M (рассматривается как округлые клетки прикреплены к поверхности).
  5. Transfт.д. клеток с использованием рекомендаций Amaxa Nucleofector следующие производителя. Для использования фибробластов NHDF решения и программу U20. Для трансфекции, урожай клетки из двух 100 мм пластин (~ 2x10 6 клеток). Очень важно, чтобы не более trypsinize клеток. Стоп трипсинизации, как только 80% клеток отделяется от пластины. Ресуспендируют клетки в растворе NHDF. Клетки чувствительны к решению NHDF, следовательно, минимизировать время инкубации и смешать клетки мягко. Трансфекции клеток с 0,5 мкг линеаризованной построить репортер. Эти условия трансфекции, когда используется с нормальными человеческими фибробластами в результате интеграции одну копию репортер построить для большинства integrants.
  6. Выделите ячейки с хромосомным интегрированных конструкций репортер, добавляя 1 мг / мл генетицину (G418) 24 часа после трансфекции. Продолжить выбор в течение 7-10 дней.
  7. Выберите G418 устойчивы колонии (вы можете выбрать отдельные колонии или бассейн устойчивые клоны). Развернуть культура примерно в пять 100 мм пластин. Заморозить трех пластин для использования в будущем и расширить оставшихся двух пластин нужную ячейку число (обычно десять 100 мм пластин достаточно в течение пяти трансфекции).
  8. Когда клетки достигают 70-80% слиянии (через два дня после покрытия 5х10 5 клеток на 100 мм пластины для фибробластов), клетки готовы к трансфицированных I-SCEI выражения плазмиды.

3. Индукция DSB от переходных Выражение I-SCEI эндонуклеаза

  1. Трансфекции ~ 2x10 6 клеток (две пластины) логарифмически растущей культуры смесью 5 мкг I-SCEI выражения плазмиды и 0,1 мкг pDsRed2-N1 (Clontech) в качестве контроля эффективности трансфекции использованием Amaxa Nucleofector (использование NHDF решения и U20 программы для фибробластов ).
  2. В то же время подготовить три контроль калибровки для FACS по trasfecting ~ 2x10 6 клеток с (я) 5 мкг EGFP экспрессирующих плазмид, (II) 5 мкг pDsRed2-N1; (III) 5 мкг плазмиды контроль, который не выразить флуоресцентного белка (мы используем плазмиды, кодирующей HPRT minigene).
  3. Рост клетки в течение четырех дней, чтобы обеспечить достаточное время для выражения GFP и DsRed белков.
  4. (Дополнительно) Через три дня после трансфекции проверить эффективность трансфекции и экспрессии GFP и DsRed белков методом флуоресцентной инвертированный микроскоп с фильтрами для обнаружения GFP и DsRed.

4. Анализ GFP + и DsRed + клеток методом проточной цитометрии

  1. Через четыре дня после трансфекции жатвы я-SCEI трансфекции клеток и контрольных клеток. Ресуспендируют клеток в 500 мкл PBS и передачи клеткам FACS труб. На этом этапе очень важно собрать все клетки и клетки округлой формы. Для достижения этой цели рекомендуется использовать длительное время трипсинизации или сильнее трипсина. Подтвердите, что 99% клеток отделяются от плиты и имеют округлую форму, наблюдая клетки под микроскопом. Держите клетки на льду в защищенном от света (ледяного покрова ведро с фольгой). Можно хранить клетки на льду в течение нескольких часов. Для достижения наилучших результатов анализа клетки сразу после сбора урожая.
  2. Калибровка FACS с GFP, DsRed и отрицательные контроли. Отрегулируйте напряжение и цветовой коррекцией, с тем чтобы включить все флуоресцентных клеток в анализе (рис. 4). Имейте в виду, что люминесцентные интенсивность экспериментальных образцов будет ниже, чем в контрольной группе.
  3. Анализ I-SCEI трансфекции клеток FACS. Мы рассчитываем минимум 20.000 ячеек для каждой процедуры. Для предотвращения возникновения помех между GFP и DsRed флуоресценции рекомендуется держать процентов GFP + или DsRed + клеток ниже 25%. Если процент DsRed + или GFP + клеток выше, уменьшить количество pDsRed2-N1 или я-SCEI плазмиды. В наших экспериментах мы только, необходимых для корректировки количества pDsRed2-N1 плазмиды, но не я-SCEI плазмиды.
  4. Процентов GFP + клеток соответствует эффективности репарации ДНК DSB и процентов DsRed + клеток указывает на эффективность трансфекции. Рассчитать относительную эффективность репарации ДНК DSB как отношение GFP + клеток к DsRed + клеток.
  5. Отремонтировать переходы конце концов, могут быть упорядочены для проверки точности ремонта. Репортер конструкции содержат E.coli начала репликации и гены устойчивости к канамицину (рис. 1). Это позволяет спасать конструкций путем переваривания геномной ДНК с помощью EcoRI фермент, recircularization, и превращение в компетентных клеток E.coli. Спас плазмиды затем анализировали пищеварение ограничения и последовательности.

5. Представитель Результаты

Типичные результаты FACS управления трансфекции и NHEJ и кадровых экспериментов приведены на рисунках 4 и 5. Флуоресцентные интенсивность и количество флуоресцентных клетки будут ниже в I-SCEI трансфекции клеток, содержащих интегред NHEJ и HR конструкции (рис. 5) по сравнению с контрольной группой (рис. 4) из-за разницы в число копий GFP и DsRed конструкции в этих клетках. Каждая ячейка в эксперименте содержит только одну копию интегрированной построить репортером, таким образом, успешные мероприятия ремонт будет воссоздать геном GFP во фракции клеток. Трансфекция с 0,1 мкг pDsRed2-N1 в человеческих фибробластов обеспечивает примерно 1 плазмиды копию на ячейку.

Эффективность NHEJ и HR рассчитывается как отношение GFP + / DsRed + клеток. NHEJ является более эффективным процессом, чем HR в клетках человека 2. В человеческих фибробластов эффективности NHEJ, как правило, 0,6-1,3 и HR эффективность 0,05-0,3. С DSB эффективность измеряется как отношение GFP + / + клеток DsRed изменения в смеси I-SCEI и DsRed2-N1 плазмиды могут повлиять на результат. Плазмиды качество может также повлиять на результаты, изменив эффективности трансфекции. Поэтому для получения последовательного измерения, важно использовать те же плазмиды смесь в течение одного эксперимента. Кроме того, эффективность DSB ремонта зависит от типа клеток, фазы клеточного цикла, и хромосомные расположение интегрированных конструкций.

Рисунок 1
Рисунок 1. Репортер конструкции для анализа репарации ДНК DSB по NHEJ (А) и HR (B). (C) является несовместимым ДНК концы порожденных пищеварения двух перевернутой I-SCEI сайтов SD, сращивание доноров; С.А., сращивание акцептора; затененных площадей, сайты полиаденилирования; Neo / Кана, одного ORF контролируется двумя промоутерами. SV40 присвоении устойчивости к неомицину млекопитающих клеток, а β-лактамазы присвоении kanamicyn сопротивления в E.coli, Ори, Е. Coli PUC начала репликации.

Рисунок 2
Рисунок 2. Репортер построить для анализа NHEJ В этой конструкции GFP ген неактивными;. Однако по индукции NHEJ DSB и успешных построить становится GFP +. Ниже показан ремонт продукт этого репортера по NHEJ.

Рисунок 3
Рисунок 3. Репортер построить для анализа HR путем генной конверсии. По индукции ДР М-SCEI, HR путем генной конверсии (GC) воссоздает активного гена GFP. Ниже приведены ремонт продукты этого репортера на основные пути репарации ДНК: GC, кроссинговера (X-Over), одну прядь отжига (SSA), и NHEJ. X-за ремонта изделия представлен для внутримолекулярной рекомбинации, exramolecular рекомбинации даст тот же продукт, но расположенных на одной хромосоме. Гены выразить активный белок GFP (GFP +) обозначены зеленым цветом.

Рисунок 4
Рисунок 4. Калибровка параметров для анализа FACS. () Фибробласты трансфицированных pHPRT плазмиды, используемые в качестве отрицательного контроля для исключения автоматического флуоресцентных клеток. (B) Фибробласты трансфицированных pEGFP плазмиды, используется для установки литниковой для GFP + клеток (зеленая зона). (C) Фибробласты трансфицированных pDsRed2-N1 плазмиды, используется для установки литниковой для DsRed клетки + (красная зона).

Рисунок 5
Рисунок 5. Типичные результаты анализа NHEJ (А) и HR (B) в нормальных человеческих фибробластов с хромосомным интегрированных конструкций репортер.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Флуоресцентные NHEJ и анализы HR репортер обеспечить количественный способ измерения отдельно каждого пути DSB ремонт в естественных условиях. Тесты очень чувствительны, как FACS может надежно обнаружить 10 клеток GFP + в 20000 клеток. Анализы могут быть адаптированы для измерения ремонт событий в "реальном времени", обнаруживая появление GFP + клеток в течение нескольких минут или часов после индукции ДР 2. Кроме того, анализ GFP + клеток не зависит от дополнительного пролиферации клеток, что позволяет DSB ремонта должны быть проанализированы на различных стадиях клеточного цикла после лечения с помощью различных препаратов, что разделение остановку клеточного 6. Это обеспечивает важные преимущества по сравнению с репортером конструкций на основе воссоздания селективного маркера.

Процесс NHEJ неразрывно ошибок генерации различных мелких перестановок на концах узлы. Уникальная особенность нашего корреспондента NHEJ в том, что ремонт события происходят в пределах интронов, которые терпит удаления и вставки, тем самым позволяя обнаружение широкого спектра событий NHEJ. Построить HR основан на том же модифицированный ген GFP в качестве NHEJ построить позволяет сравнительный анализ NHEJ и HR. Использование флуоресцентных NHEJ и HR анализов будет способствовать изучению млекопитающих ремонт DSB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Оригинальные GFP-Pem1 был подарок от доктора Лэй Ли. Эта работа была поддержана грантами NIH и Эллисон Медицинский фонд В. Г. и А. С.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EndoFree Plasmid Maxi kit Qiagen 12362
Qiaex II Gel Extraction Kit Qiagen 20021
Amaxa Nucleofector Lonza Inc. AAD-1001
Geneticin (G418) Invitrogen 11811-031
pDsRed2-N1 Clontech Laboratories 632406
Round bottom tubes BD Biosciences 352058 FACS tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
  2. Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
  3. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
  4. Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
  5. Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
  6. Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).

Tags

Клеточной биологии выпуск 43 репарации ДНК HR NHEJ клетки млекопитающих
Анализ ДНК двухцепочечной Break (DSB) Ремонт в клетках млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. More

Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (43), e2002, doi:10.3791/2002 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter