Summary
이 문서는 GFP 기반의 형광을 설명합니다
Abstract
DNA 이중 가닥의 휴식 시간은 유전 정보 및 세포 사망의 대규모 손실로 이어질 수있는 가장 위험한 DNA의 병변입니다. 가입 nonhomologous 엔드 (NHEJ)와 상동 재조합 (HR) : 두 가지 주요 경로를 사용하여 셀 수리 DSBs. NHEJ와 HR의 Perturbations 자주 조기 노화와 tumorigenesis와 관련된, 따라서 그것은 각 DSB 복구 경로을 측정하는 양적 방법이 중요합니다. 저희 연구실은 NHEJ와 HR의 민감하고 정량적 측정을 허용 형광 리포터 구조를 개발했습니다. 구성은 DSBs의 유도를위한 드문 절감 I - SceI의 endonuclease에 대한 인식 사이트를 포함하는 설계 GFP 유전자를 기반으로합니다. GFP 유전자가 추가 엑슨에 의해 inactivated, 또는 돌연변이에 의해 그대로 시작 구조는 GFP 아무것도 없습니다. NHEJ 또는 HR하여 I - SceI 유발 나누기의 성공적인 복구 기능 GFP 유전자를 복원합니다. 유동세포계측법로 가늠 GFP 양성 세포의 수는 NHEJ 또는 HR 효율 양적 측정을 제공합니다.
Protocol
이 프로토콜에서는 DSBs가 과도 표현 드문 절삭 endonuclease I - SceI 3 생체내에서 유도된 아르 1,2를 구성 chromosomally 통합 기자와 DNA DSB 복구 분석하는 방법을 설명합니다. 통합 분석은 염색체 컨텍스트 내에서 DSB 복구를 분석의 이점을 제공합니다. 그러나,이 프로토콜은 기본 세포와 함께 작업할 때 문제가있을 수 있습니다 passaging 장시간 휴대를 필요로합니다.
대체 접근법은 기자 구조가 I - SceI이나 HindIII의 endonucleases와 체외에서 소화하고 선형 DNA로 세포에 transfected 아르 extrachromosomal 분석이다. exctrachromosomal 분석 프로토콜 4 다음 수정을 아래에서 설명하는 통합 분석과 유사합니다. extrachromosomal 분석은 기자 구조의 통합을 생략하고 대신 I - SceI이나 HindIII와 transfection 제어와 같은 pDsRed2 - N1의 0.1 μg과 함께 체외로 선형 플라스미드 NHEJ 기자의 0.5 μg으로 세포를 공동 transfect하십시오. HR 분석을위한 플라스미드 공동 transfect 2 μg의 인사 기자 I - SceI이나 HindIII와 0.1 μg pDsRed2 - N1과 선형. transfection 후 외과 삼일하여 세포를 분석할 수 있습니다. extrachromosomal 분석은 passaging 광범위한 세포를 피하고, 여러 세포 라인의 분석을 촉진, 기본 격리에 DSB 복구의 분석을 위해 수 있습니다.
1. NHEJ와 HR에 대한 리포터 구조
NHEJ 기자 카세트 5 Pem1 유전자 (GFP - Pem1)에서 설계 3킬로바이트 인트론과 GFP의 유전자를 포함하고 있습니다. Pem1 인트론은 DSBs의 유도를위한 HindIII와 I - SceI endonucleases (그림 1A)에 대한 인식 시퀀스 둘러싸인 adenoviral 엑슨가 포함되어 있습니다. I - SceI 사이트 거꾸로 방향에 있습니다. I - SceI가 nonpalindromic 인식 순서를 가지고, 따라서이 거꾸로 사이트가 호환되지 않는 DNA 종료 (그림 1C)을 생성합니다. 호환되지 않는 DNA가 가장 자연스럽게 발생 DSBs을 모방 끝납니다. 그대로 NHEJ 카세트는 adenoviral 엑슨은 GFP ORF를 방해 제외 GFP 있습니다. I - SceI로 DSBs의 유도되면, adenoviral 엑슨이 제거되고 NHEJ는 GFP 유전자 (그림 2)의 기능을 복원합니다. 이 NHEJ 기자의 독특한 기능은 인트론은 삭제 및 삽입을 용인할 수 있기 때문에 그것이 NHEJ 이벤트의 다양한 스펙트럼을 감지 수있다는 것입니다.
HR 기자 카세트 1 (그림 1B)도 GFP - Pem1을 기반으로합니다. HR 카세트에서 GFP - Pem1의 첫 번째 엑손 세 제한 사이트 I-SceI/HindIII/I-SceI의 삽입과 함께 22 BP 삭제가 포함되어 있습니다. 삭제 GFP가 NHEJ 이벤트에 의해 재구성 수 없습니다 보장합니다. 두 I - SceI 사이트 I - SceI는 소화가되지 종료 (그림 1C)을 출발하므로, 거꾸로 방향에 있습니다. GFP - Pem1의 첫 번째 복사본은 GFP - Pem1의 promoter-less/ATG-less 첫번째 엑손과 인트론옵니다. 그대로 구조는 GFP 음수입니다. I - SceI의 소화에 의해 DSB의 유도에 따라 기능 GFP 유전자가 처음으로 GFP - Pem1의 엑슨의 두 변이 사본 사이의 분자내 또는 분자간 유전자 변환하여 재구성합니다. GFP 유전자의 두 번째 복사본은, 첫 번째 ATG 코돈의 두 번째 엑손을 부족한 넘고 또는 단일 스트랜드 어닐링이기 때문에하면 GFP 활동을 복원하지 않습니다. 이 디자인은 포유 동물 세포에서 지배 HR 경로 (그림 3)입니다 유전자 변환의 독점적인 검색을 위해 수 있습니다.
2. 기자의 통합 게놈으로 구성
- NHEJ 또는 HR 기자 플라스미드의 양질의 준비를합니다. 최상의 결과는 Qiagen 엔도 무료 키트를 사용하십시오. 280분의 260 nm의 흡광도에서 플라스미드의 농도 및 순도를 측정합니다.
- 50 μl의 NheI 50 U (반응의 전체 볼륨) 37 6 시간 동안 함께 소화에 의해 플라스미드 기자 10 μg을 Linearize ° C 배양기 (증발을 방지하기 위해, 건조 블록을 사용하지 마십시오.) Qiagen QiaexII 키트, 10 MM 트리스 - HCL pH는 8.0 20 μl로 elute DNA와 소화 솔루션에서 DNA를 정화. 280분의 260 nm의 흡광도에서하여 DNA 농도 및 순도 측정. 보통, 당신은 정화하는 동안 DNA의 20~30%을 잃게됩니다. 소화되지 않은 기자 건설과 함께 젤에 작은 나누어지는 (2 μl)를 실행하여 수율과 소화를 확인합니다. 정화 기자 선형 구조는 20 ° C.에 저장할 수 있습니다
- transfection을위한 준비에서 최고의 성장 상태로 전지를 가져와. 냉동 유리병에서 시작하는 경우, transfection 전에 두 번 세포를 분리. 합류 세포의 접시부터 시작하는 경우 한 번 그들을 분할.
- 70-80%의 합류 (보통 일반적인 인간의 섬유아 세포 이틀 동안, 도금 5x10 5 cells/100 mm 판 경우)에 세포를 성장. 그것은 대수 성장에 세포를 가져 최고의 transfection 효율을 위해 중요합니다. 적극적으로 성장하는 문화는 M 단계에서 세포를 (표면에 부착된 둥근 세포로 본)이 포함되어 있습니다.
- TransfAmaxa Nucleofector의 다음 제조 업체의 권장 사항을 사용하여 셀을 요법. 섬유아 세포는 NHDF 솔루션 및 프로그램 U20을 사용하십시오. transfection에 대한 두 개의 100mm 접시 (~ 2x10 6 세포)에서 세포를 수확. 그것은 이상 세포를 trypsinize하지 않는 것이 중요합니다. 빨리 접시에서 분리 세포의 80 %로 trypsinization를 중지합니다. NHDF 솔루션에있는 세포를 Resuspend. 세포 NHDF 솔루션으로 구분되며, 따라서 부화 시간을 최소화하고 부드럽게 세포를 섞는다. 선형 기자 구조 0.5 μg으로 세포를 Transfect. 기자의 단일 복사본의 통합에 정상적인 인간의 섬유아 세포의 결과와 함께 사용이 transfection 조건은 integrants의 대부분을 구성.
- transfection 후 1 MG / ML geneticin (G418) 24 시간을 추가하여 chromosomally 통합 기자 구조와 세포를 선택합니다. 70-10일에 대한 선택을 계속합니다.
- G418 모성 식민지를 (여러분이 개별 식민지 또는 수영장 저항력 클론을 선택할 수 있습니다) 선택하십시오. 약 5 100mm 접시에 문화를 확장합니다. 나중에 사용할 세 접시를 고정하고 원하는 휴대폰 번호 (일반적으로 열 100mm 플레이트 다섯 transfections에 대한 충분)로 남은 두 접시를 확장합니다.
- 세포 70-80%의 합류 (이일 섬유아 세포에 대한 100mm 플레이트 당 5x10 5 세포를 도금 후)에 도달하면 세포는 I - SceI이 플라스미드 표현과 transfected 준비하고 있습니다.
3. I - SceI의 Endonuclease의 과도 표현에 의해 DSB의 유도
- Transfect Amaxa Nucleofector을 (섬유아 세포에 대한 NHDF 솔루션과 U20 프로그램을 사용하여 사용하여 transfection 효율 제어로 플라스미드와 0.1 μg pDsRed2 - N1 (Clontech)를 표현 5 μg I - SceI의 혼합물로 logarithmically 성장 문화의 ~ 2x10 6 셀 (두 접시) ).
- (2) 5 μg pDsRed2 - N1,, 제어 (3) 5 μg 플라스미드을 표현하지 않는 동시에 5 μg은 EGFP - 표현 플라스미드 것은 (I)와 함께 ~ 2x10 6 세포를 trasfecting하여 외과 세 보정 컨트롤을 준비 형광 단백질 (우리가 플라스미드 인코딩 HPRT minigene를 사용하고있다).
- GFP와 DsRed 단백질의 표현을위한 충분한 시간을 제공하기 위해 나흘 동안 세포를 성장.
- transfection 후 GFP와 DsRed의 검출에 대한 필터와 형광 현미경에 의해 거꾸로 transfection과 GFP와 DsRed 단백질의 표현의 효율성을 확인 (선택 사항) 3 일.
4. 유동세포계측법하여 GFP +와 DsRed + 세포 분석
- 나흘 transfection 수확 I - SceI transfected 세포 및 제어 세포 후에. PBS 500 μL의 세포를 Resuspend 및 외과 튜브에 세포를 전송할 수 있습니다. 이 단계에서 그것은 모든 세포를 수확하고 둥근 모양의 세포를 가지고하는 것이 중요합니다. 이것을 달성하기 위해, 그것은 더 이상 trypsinization 시간이나 강한 트립신을 사용하는 것이 좋습니다. 세포의 99 %가 접시에서 분리되었는지 확인하고 현미경으로 세포를 관찰하여 둥근 모양을했습니다. (호일로 얼음 양동이 커버) 빛으로부터 보호 얼음 세포 보관하십시오. 몇 시간 동안 얼음에 세포를 저장하는 것이 가능합니다. 를 위해 최상의 결과를 즉시 수확 후 세포를 분석할 수 있습니다.
- GFP, DsRed, 그리고 부정적인 컨트롤과 함께 외과를 보정합니다. 분석의 모든 형광 세포를 (그림 4) 포함하기 위해 전압 및 색상 보정을 조정하십시오. 실험 샘플의 형광 강도는 컨트롤보다 낮은 될 것을 명심하십시오.
- 분석 I - SceI 외과의 세포를 transfected. 우리는 각각의 치료를 위해 최소한 2 만 셀을 계산합니다. GFP와 DsRed 그 25 % 이하로 GFP의 퍼센트 이상 또는 DsRed + 세포를 유지하는 것이 좋습니다 형광. 사이에 잠재적인 간섭을 방지하기 위해 DsRed + 또는 GFP + 세포의 비율이 높은 경우 pDsRed2 - N1 또는 I - SceI 플라스미드의 양을 줄일 수 있습니다. 우리 실험에서 우리는 플라스미드 pDsRed2 - N1의 양을 조정하는 데 필요한,하지만 I - SceI 플라스미드니다.
- GFP + 세포의 %가 DNA DSB 복구의 효율성에 해당하고 DsRed + 세포의 비율은 transfection의 효율성을 나타냅니다. DsRed + 세포에 GFP + 세포의 비율로 DNA DSB 복구의 상대적 효율성을 계산.
- 수리 최종 분기점은 수리의 정확성을 테스트하기 위해 합성 수 있습니다. 기자의 구조 복제 E.coli의 기원과 kanamycin 저항 유전자 (그림 1)가 포함되어 있습니다. 이것은 효소 EcoRI, recircularization 및 관할 E.coli 세포에 변화와 게놈 DNA를 소화하여 구조를 구조 수 있습니다. 구조 plasmids은 다음 제한 소화 및 시퀀싱에 의해 분석됩니다.
5. 대표 결과
제어 transfections 및 NHEJ 및 HR 실험의 일반 외과의 결과는 그림 4와 5에 표시됩니다. 형광 강도와 형광 세포의 수가 integrat를 포함하는 I - SceI transfected 세포에 낮은 것입니다에드 NHEJ 및 HR 구조 (그림 5) GFP 이러한 세포에서 DsRed 구성의 사본 번호의 차이에 의한 제어 (그림 4)에 비해. 실험의 각 셀에 통합 기자 구조의 한 복사본을 포함하므로 성공적인 복구 이벤트 reconstitute은 세포의 일부에서 GFP 유전자 것입니다. 인간의 섬유아 세포에서 0.1 μg pDsRed2 - N1과 Transfection은 세포 당 약 1 플라스미드 사본을 제공합니다.
NHEJ과 HR의 효율성은 GFP + / DsRed + 세포의 비율로 계산됩니다. NHEJ 2 인간의 세포에서 HR보다 더 효율적인 프로세스입니다. 인간의 섬유아 세포에서 NHEJ 효율은 일반적으로 0.6-1.3이며, HR 효율 0.05-0.3입니다. DSB 효율이 비율 GFP로 측정되기 때문에 + / DsRed + I - SceI 및 DsRed2 - N1의 plasmids의 혼합물에서 세포의 변화가 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 플라스미드의 품질 또한 transfection 효율을 변경하여 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 지속적인 측정을 얻으려면, 그것도 한 실험 이내에 동일한 플라스미드 믹스를 사용하는 것이 중요합니다. 또한, DSB 복구 효율 세포 유형, 세포주기 단계와 통합 구조의 염색체 위치에 의해 영향을받습니다.
그림 1. 기자 NHEJ (A)와 HR (B)에 의해 DNA DSB 복구의 분석을 위해 구조. (C) 호환되지 않는 DNA는 두 거꾸로 I - SceI 사이트의 소화에 의해 생성된 종료 SD, 스플 라이스 기증자는, SA, 스플 라이스 수용체, 음영 사각형, polyadenylation 사이트, 네오 / 카나, 하나의 ORF는 두 발기인에 의해 제어 :.에서는 SV40 부여 네오 마이신 저항 포유 동물 세포 및 E. 대장균의 β - lactamase 부여 kanamicyn 저항, 오라, E. 대장균 pUC 복제 기원.
그림 2. . 기자 NHEJ의 분석을 위해 구성이에서 GFP 유전자가 비활성 상태 구조 있으나 DSB 성공 NHEJ의 유도에 따라 구성이 GFP +집니다. 아래와 같이하면 NHEJ하여이 기자의 수리 제품입니다.
그림 3. 기자는 유전자 변환하여 HR의 분석을 위해 구조. 유전자 변환 (GC)에 의해 I - SceI, HR에 의해 DSBs의 유도시 적극적인 GFP 유전자를 재구성. GC, 크로싱 오버 (X - 이상), 단일 스트랜드 (SSA) 어닐링하고 NHEJ : 아래의 주요 DNA 복구 경로에서이 기자의 수리 제품입니다. X - 이상 수리 제품이 분자내 재조합 표시되는, exramolecular 재조합 같은 제품을 제공 하나의 염색체에 위치합니다. 적극적인 GFP 단백질을 표현하는 유전자 (GFP +) 녹색으로 표시됩니다.
그림 4. 외과 분석을위한 매개 변수의 보정. (A) 섬유아 세포가 자동 형광 세포를 제외위한 대조군으로 사용, 플라스미드 pHPRT와 transfected. (B) 섬유아 세포가 GFP + 세포 (녹색 영역)의 게이팅 설정을 사용, 플라스미드 pEGFP와 transfected. (C) 섬유아 세포는 DsRed + 세포 (적색 영역)의 게이팅 설정에 사용되는 플라스미드 pDsRed2 - N1와 transfected.
그림 5. chromosomally 통합 기자 구조와 정상적인 인간의 섬유아 세포에서 NHEJ (A)와 HR (B)의 분석의 전형적인 결과입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
형광 NHEJ 및 인사 기자 assays은 별도로 생체내 각 DSB 복구 경로를 측정하기위한 양적 방법을 제공합니다. 외과 안정 20000 세포에서 10 GFP의 + 세포를 검색할 수 assays 매우 민감합니다. assays는 DSBs 2의 유도 후 몇 분, 아님 몇 시간 이내에 GFP + 세포의 모양을 감지하여 "실시간"에 복구 이벤트를 측정하기위한 적응 수 있습니다. 또한, GFP + 세포의 분석 DSB 복구가 다양한 약물 치료되는 체포 세포 분열 여섯 후 다른 세포주기 단계에서 분석 수 있도록 추가 세포 증식에 의존하지 않습니다. 이것은 선택 마커의 reconstitution에 따라 기자 구성을 통해 중요한 이점을 제공합니다.
NHEJ 과정은 본질적으로 종료의 분기점에서 오류가 발생하기 쉬운 생성 다양한 작은 rearrangements합니다. 우리 NHEJ 기자의 독특한 속성이 수리 이벤트가 있으므로 NHEJ 이벤트의 다양한 스펙트럼의 검출을 허용, 삭제 및 삽입을 허용 인트론 내에 발생한다는 것입니다. NHEJ가 NHEJ과 HR의 비교 분석을 허용하는 구조로 인사 구조는 동일한 수정 GFP 유전자를 기반으로합니다. 형광 NHEJ 및 인사 assays의 사용은 포유류의 DSB 복구의 연구를 용이하게합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
원래 GFP - Pem1 박사 레이 리의 선물했다. 이 작품은 NIH와 엘리슨 의료 재단에서 VG에 부여하여 이름으로 지원했습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| pDsRed2-N1 | Clontech Laboratories | 632406 | |
| Round bottom tubes | BD Biosciences | 352058 | FACS tubes |
References
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
