Summary
توضح هذه المقالة GFP المستندة مضان
Abstract
الحمض النووي المزدوج الجديلة هي الحمض النووي أخطر الآفات التي قد تؤدي الى خسارة هائلة من المعلومات الوراثية وموت الخلايا. DSBs إصلاح الخلايا باستخدام مسارين رئيسيين : نهاية امتماثلان الانضمام (NHEJ) وإعادة التركيب مثلي (HR). غالبا ما ترتبط الاضطرابات من NHEJ والموارد البشرية مع الشيخوخة المبكرة ، وتكون الأورام ، وبالتالي فإنه من المهم أن يكون وسيلة لقياس الكمية لكل مسار إصلاح جهاز تسوية المنازعات. وقد وضعت مختبرنا يبني مراسل الفلورسنت التي تسمح للقياس الكمي للحساسية وNHEJ والموارد البشرية. تستند يبني على الجينات التي تحتوي على مواقع GFP المهندسة الاعتراف لنوكلياز داخلية I - SCEI القطع النادرة لتحريض DSBs. ويبني بدءا من GFP سلبية كما هو المعطل الجين GFP قبل اكسون إضافية ، أو عن طريق الطفرات. إصلاح الناجح للفواصل I - SCEI المستحثة بواسطة NHEJ الموارد البشرية أو يستعيد GFP الجينات الوظيفية. عدد الخلايا التي GFP ايجابية تحسب التدفق الخلوي يوفر قياس الكمي لNHEJ أو كفاءة الموارد البشرية.
Protocol
في هذا البروتوكول وصفنا طريقة لتحليل الحمض النووي للإصلاح DSB مع الصحافي متكاملة صبغويا يبني 1،2 حيث يتسبب في الجسم الحي بواسطة DSBs التعبير عابرة a نوكلياز داخلية قطع نادرة SCEI I - 3. في مقايسة متكامل يوفر ميزة تحليل DSB في إطار إصلاح الكروموزومات. ومع ذلك ، هذا البروتوكول يتطلب خلية الركض لفترات طويلة ، والتي قد تكون مشكلة عند العمل مع الخلايا الأولية.
نهج بديل هو مقايسة خارج الصبغي حيث يتم هضمها مراسل يبني في المختبر مع I - SCEI أو endonucleases HindIII transfected ثم الى خلايا الحمض النووي والخطية. بروتوكول مقايسة exctrachromosomal 4 مشابهة للمقايسة المتكاملة المبينة أدناه مع التعديلات التالية. لمقايسة خارج الصبغي حذفت تكامل البنى مراسل وبدلا من ذلك التعاون transfect الخلايا مع 0.5 ميكروغرام من مراسل NHEJ البلازميد الخطي في المختبر مع I - SCEI أو HindIII و 0.1 ميكروغرام من pDsRed2 - N1 والسيطرة ترنسفكأيشن. لمقايسة HR خطي المشترك transfect HR 2 ميكروغرام مراسل البلازميد مع SCEI - I أو HindIII و 0.1 ميكروغرام pDsRed2 - N1. تحليل الخلايا عن طريق ثلاثة أيام بعد ترنسفكأيشن FACS. في مقايسة خارج الصبغي يسمح لتحليل اصلاح جهاز تسوية المنازعات في عزلة الابتدائي ، وتجنب الركض الخلية واسعة ، وتسهيل تحليل خطوط الخلايا متعددة.
1. يبني مراسل NHEJ والموارد البشرية
الكاسيت مراسل NHEJ 5 يحتوي الجين GFP مع إنترون المهندسة كيلوبايت 3 من الجينات Pem1 (GFP - Pem1). ال intron Pem1 يحتوي على اكسون الفيروسة الغدانية يحيط بها سلاسل من أجل الاعتراف endonucleases HindIII وأنا SCEI (الشكل 1A) لتحريض DSBs. مواقع I - SCEI في اتجاه معكوس. I - SCEI وتسلسل الاعتراف nonpalindromic ، وبالتالي توليد موقعين مقلوب تاريخ الحمض النووي يتعارض (الشكل 1C). الحمض النووي يتعارض ينتهي تحاكي أفضل DSBs طبيعيا. الكاسيت NHEJ سليمة هو GFP السلبية مثل اكسون الفيروسة الغدانية يعطل ORF GFP. بناء على تحريض من قبل DSBs SCEI - I ، تتم إزالة اكسون الفيروسة الغدانية وNHEJ يستعيد ظيفة الجين GFP (الشكل 2). الميزة الفريدة لهذا المراسل NHEJ هو أنه يمكن الكشف عن مجموعة واسعة من الأحداث NHEJ منذ إنترون يمكن أن يتسامح مع الحذف والإدراج.
ويستند أيضا على شريط كاسيت مراسل HR 1 (الشكل 1B) في GFP - Pem1. الكاسيت في الموارد البشرية ، واكسون الأول من GFP - Pem1 يحتوي على الحذف غليان 22 جنبا إلى جنب مع ادراج المواقع تقييد الثلاثة ، I-SceI/HindIII/I-SceI. الحذف لا يمكن أن يضمن أن يعاد تشكيل GFP عن حدث NHEJ. وهما I - SCEI المواقع هي في اتجاه معكوس ، بحيث I - SCEI الهضم يترك ينتهي يتنافى (الشكل 1C). يتبع النسخة الأولى من GFP - Pem1 بواسطة اكسون أول promoter-less/ATG-less وإنترون من GFP - Pem1. وبناء سليما هو GFP سلبية. بناء على تحريض من قبل I - DSB SCEI الهضم هو تشكيل لجينة GFP الفنية من خلال التحويل الجيني أو الجزيئات ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ بين نسختين من تحور اكسون GFP - Pem1 الأولى. ومنذ النسخة الثانية من الجين GFP تفتقر إلى رامزة ATG الأول واكسون الثانية ، أو عبور الصلب واحدة حبلا لا استعادة النشاط GFP. هذا التصميم يسمح للكشف الحصري لتحويل الجينات ، والذي هو مسار الموارد البشرية السائدة في خلايا الثدييات (الشكل 3).
2. تكامل مراسل يبني في الجينوم
- تقديم الجودة العالية لإعداد أو NHEJ مراسل HR البلازميد. للحصول على أفضل النتائج استخدام أدوات مجانية Qiagen إندو. قياس تركيز البلازميد والنقاء التي الامتصاصية في 260 / 280 نانومتر.
- يصبح خطي 10 ميكروغرام من البلازميد بواسطة مراسل هضم مع 50 من U NheI في 50 ميكرولتر (إجمالي حجم رد الفعل) لمدة 6 ساعات في 37 درجة مئوية الحاضنة (لا تستخدم كتلة جافة ، لمنع التبخر). تنقية الحمض النووي من الحل الهضم مع Qiagen QiaexII كيت ، أزل الحمض النووي في 20 ميكرولتر من 10 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك ملي تريس - 8.0. قياس تركيز الحمض النووي والنقاء التي الامتصاصية في 260 / 280 نانومتر. عادة ، سوف تخسر 20-30 ٪ من الحمض النووي خلال تنقية. تأكيد المحصول والهضم عن طريق تشغيل قسامة الصغيرة (2 ميكرولتر) على هلام ، جنبا إلى جنب مع بناء مراسل عسر الهضم. ويمكن تخزين المنقى بناء مراسل خطي في 20 درجة مئوية.
- استعدادا لترنسفكأيشن ، وجعل الخلايا إلى حالة أفضل المتنامية. إذا بدءا من قارورة المجمدة ، وانقسام الخلايا مرتين قبل ترنسفكأيشن. إذا بدءا من لوحة خلايا متكدسة ، تقسيمها مرة واحدة.
- تنمو الخلايا لالتقاء 70-80 ٪ (عادة يومين ، إذا طبق مطلي 5x10 5 ملم cells/100 ، لالليفية الإنسان العادي). فمن الأهمية بمكان بالنسبة لكفاءة أفضل ترنسفكأيشن لجعل الخلايا في النمو لوغاريتمي. الثقافة بنشاط متزايد يحتوي على خلايا في مرحلة M (ينظر إليها على أنها مقربة الخلايا التي تعلق على السطح).
- Transfإلخ الخلايا باستخدام التوصيات التالية Nucleofector Amaxa المصنعة لل. لاستخدام الخلايا الليفية NHDF الحل وU20 البرنامج. لترنسفكأيشن ، حصاد الخلايا اثنين من 100 ملم لوحات (~ 2x10 6 خلايا). فمن الأهمية بمكان ألا يعرض للتريبسين على الخلايا. وقف trypsinization بمجرد 80 ٪ من خلايا منفصلة عن لوحة. Resuspend الخلايا في حل NHDF. خلايا حساسة للNHDF الحل ، وبالتالي ، تقليل فترة حضانة وخليط الخلايا برفق. Transfect الخلايا مع 0.5 ميكروغرام من بناء مراسل الخطي. هذه الشروط ترنسفكأيشن ، عندما تستخدم مع الإنسان العادي نتيجة الليفية في إدماج نسخة واحدة من مراسل بناء لغالبية integrants.
- حدد الخلايا مع ثوابت مراسل متكاملة صبغويا بإضافة 1 ملغ / مل geneticin (G418) بعد ترنسفكأيشن 24H. تواصل الاختيار لمدة 7-10 أيام.
- اختيار مقاومة المستعمرات G418 (يمكنك اختيار فرد أو تجمع مستعمرات استنساخ المقاومة). توسيع الثقافة إلى ما يقرب من خمس لوحات 100 ملم. تجميد ثلاث لوحات لاستخدامها في المستقبل وتوسيع المتبقيتين لوحات لعدد الخلايا المطلوب (عادة ten 100 ملم لوحات تكفي لمدة خمس transfections).
- عندما تصل الخلايا التقاء 70-80 ٪ (بعد يومين من الطلاء 5x10 5 خلايا لكل لوحة 100 ملم لالليفية) ، وخلايا جاهزة للtransfected مع I - SCEI معربا عن البلازميد.
3. تحريض DSB التعبير بواسطة عابر للI - SCEI نوكلياز داخلية
- Transfect ~ 2x10 6 خلايا (صفيحتين) من تنامي ثقافة logarithmically بمزيج من 5 ميكروغرام I - SCEI معربا عن البلازميد و 0.1 ميكروغرام pDsRed2 - N1 (Clontech) بوصفها ترنسفكأيشن السيطرة كفاءة استخدام Amaxa Nucleofector (استخدام NHDF الحل وبرنامج U20 لالليفية ).
- في الوقت نفسه إعداد الضوابط الثلاثة لمعايرة نظام مراقبة الأصول الميدانية التي trasfecting ~ 2x10 6 خلايا مع (ط) 5 ميكروغرام EGFP - معربا عن البلازميد ، (ب) 5 ميكروغرام pDsRed2 - N1 ، (ج) 5 ميكروغرام من السيطرة البلازميد التي لا تعبر عن ببروتين (نحن باستخدام ترميز البلازميد HPRT minigene).
- تنمو الخلايا لمدة أربعة أيام لتوفير الوقت الكافي للتعبير عن GFP DsRed والبروتينات.
- (اختياري) بعد ثلاثة أيام من ترنسفكأيشن التحقق من كفاءة والتعبير عن ترنسفكأيشن GFP والبروتينات الفلورية DsRed بواسطة المجهر المقلوب مع مرشحات للكشف عن وDsRed GFP.
4. تحليل GFP + وخلايا + DsRed بواسطة التدفق الخلوي
- بعد أربعة أيام من الخلايا ترنسفكأيشن I - SCEI الحصاد transfected والخلايا السيطرة. Resuspend الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل الخلايا إلى أنابيب FACS. في هذه المرحلة من المهم جدا لحصاد كل الخلايا وخلايا والشكل المستدير. لتحقيق ذلك ، فمن المستحسن استخدام وقتا أطول أو أقوى trypsinization التربسين. تأكيد أن يتم فصله من 99 ٪ من الخلايا من لوحة ولقد شكل دائري من خلال مراقبة الخلايا تحت المجهر. تبقي الخلايا على الجليد محمية من الضوء (دلو الثلج يغطي برقائق). فمن الممكن لتخزين الخلايا على الجليد لبضع ساعات. للحصول على أفضل النتائج تحليل الخلايا مباشرة بعد الحصاد.
- معايرة نظام مراقبة الأصول الميدانية مع GFP ، DsRed ، والضوابط سلبية. ضبط الجهد وتعويض اللون في لتشمل جميع الخلايا الفلورسنت في التحليل (الشكل 4). نضع في اعتبارنا أن كثافة الفلورسنت من العينات التجريبية سيكون أقل من ذلك من الضوابط.
- تحليل I - SCEI transfected الخلايا عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية. نحن نعول على الأقل 20000 خلايا لكل علاج. لمنع أي تشويش محتمل بين GFP وDsRed. مضان فمن المستحسن أن تبقي في المئة من GFP + أو + DsRed الخلايا أقل من 25 ٪ إذا كانت نسبة DsRed + + أو خلايا GFP أعلى تقليل كمية pDsRed2 - N1 أو I - SCEI البلازميد. في تجاربنا نحن بحاجة فقط إلى ضبط كمية من pDsRed2 - N1 البلازميد ، ولكن ليس من البلازميد I - SCEI
- في المئة من الخلايا + GFP يناظر كفاءة إصلاح الحمض النووي وتسوية المنازعات في المئة من خلايا + DsRed يدل على كفاءة ترنسفكأيشن. حساب الكفاءة النسبية للإصلاح الحمض النووي DSB كنسبة من الخلايا إلى خلايا + + GFP DsRed.
- قد تكون متسلسلة منعطفات نهاية إصلاح لاختبار دقة للإصلاح. ويبني مراسل احتواء القولونية أصل النسخ والجينات المقاومة الكانامايسين (الشكل 1). هذا يمكن انقاذ يبني بواسطة هضم الحمض النووي الجيني مع انزيم EcoRI ، recircularization ، والتحول الى خلايا القولونية المختصة. ويتم تحليل ثم البلازميدات انقاذ الهضم التقييد والتسلسل.
5. ممثل النتائج
وترد نموذجية FACS نتائج transfections السيطرة وNHEJ الموارد البشرية والتجارب في أرقام 4 و 5. والفلورسنت وكثافة عدد الخلايا الفلورسنت تكون أقل في الخلايا I - SCEI transfected تحتوي integratإد NHEJ ويبني الموارد البشرية (الشكل 5) بالمقارنة مع الضوابط (الشكل 4) وذلك بسبب الفرق في عدد نسخة من GFP ويبني DsRed في هذه الخلايا. كل خلية في التجربة تحتوي على نسخة واحدة فقط من بناء مراسل متكاملة ، وإصلاح الأحداث الناجحة وبالتالي إعادة الجين GFP في جزء من الخلايا. ترنسفكأيشن بنسبة 0.1 ميكروغرام pDsRed2 - N1 في الخلايا الليفية الإنسان يسلم نسخة البلازميد ما يقرب من 1 في الخلية.
ويتم احتساب كفاءة الموارد البشرية وNHEJ كنسبة من الخلايا + / + DsRed GFP. NHEJ هي عملية أكثر كفاءة من الموارد البشرية في الخلايا البشرية 2. في الخلايا الليفية الإنسان كفاءة NHEJ عادة 0،6-1،3 ، والموارد البشرية والكفاءة 0،05-،3. منذ تقاس كفاءة جهاز تسوية المنازعات باعتباره GFP نسبة + / + DsRed الخلايا قد الاختلافات في خليط من SCEI - I والبلازميدات DsRed2 - N1 يؤثر على النتيجة. قد تؤثر على نوعية البلازميد أيضا نتائج عن طريق تغيير ترنسفكأيشن الكفاءة. ولذلك ، للحصول على قياسات متناسقة ، فمن المهم استخدام نفس المزيج البلازميد داخل تجربة واحدة. وعلاوة على ذلك ، تتأثر كفاءة إصلاح جهاز تسوية المنازعات عن طريق نوع من الخلايا ، خلية دورة المرحلة ، والموقع من الكروموسومات يبني متكاملة.
الشكل 1. مراسل يبني لتحليل الحمض النووي عن طريق إصلاح DSB NHEJ (A) والموارد البشرية (B). (ج) الحمض النووي التي تم إنشاؤها بواسطة غير متوافق ينتهي هضم موقعين I - SCEI مقلوب SD ، لصق المانحة ؛ SA ، لصق متقبل ؛ الساحات المظللة ، ومواقع تذييل بعديد الأدينيلات ؛ الجدد / قانا ، واحد للرقابة من قبل اثنين من ORF المروجين : SV40 المقاومة في منح النيوميسين الثدييات الخلايا ، وβ - اكتاماز المقاومة kanamicyn تمنح في كولاي ، أوري ، E. الأصل القولونية PUC من تكرارها.
الشكل 2. مراسل بناء على تحليل بناء NHEJ وفي هذا الجين GFP غير نشط ، إلا أنه بناء على تحريض من NHEJ DSB وناجحة لبناء يصبح GFP +. المبينة أدناه هي نتاج إصلاح هذا المراسل من قبل NHEJ.
الشكل 3. مراسل بناء على تحليل الموارد البشرية عن طريق تحويل الجينات. عند تحريض على DSBs بواسطة I - SCEI ، والموارد البشرية عن طريق تحويل الجينات (GC) يعيد جين GFP النشطة. المبينة أدناه هي منتجات إصلاح هذا المراسل عن إصلاح الحمض النووي مسارات رئيسية هي : GC ، الإفراط في معبر (X - فوق) ، واحدة حبلا الصلب (جنوبي) ، وNHEJ. ويظهر على X - منتج لتصليح ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ إعادة التركيب ، وإعادة التركيب exramolecular إعطاء نفس المنتج ولكن يقع على كروموسوم واحد. التعبير عن الجينات النشطة البروتين GFP (GFP +) بالرمز اللون الأخضر.
الشكل 4. معايرة معايير لتحليل FACS (A) مع الخلايا الليفية transfected pHPRT البلازميد ، كما تستخدم لمراقبة سلبية على الخلايا باستثناء السيارات الفلورسنت. (ب) مع الخلايا الليفية transfected pEGFP البلازميد ، وتستخدم لتحديد الخلايا النابضة لGFP + (المنطقة الخضراء). (C) مع الخلايا الليفية transfected - N1 pDsRed2 البلازميد ، وتستخدم لتحديد الخلايا النابضة لDsRed + (المنطقة الحمراء).
الشكل 5. نموذجي نتائج تحليل NHEJ (A) والموارد البشرية (B) في الخلايا الليفية الإنسان العادي مع ثوابت مراسل صبغويا متكاملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وNHEJ الفلورسنت والمقايسات مراسل الموارد البشرية توفر وسيلة لقياس الكمي بشكل منفصل لكل مسار إصلاح جهاز تسوية المنازعات في الجسم الحي. والمقايسات حساسة للغاية ، ويمكن الكشف عن FACS موثوق بها 10 خلايا + 20000 GFP في الخلايا. يمكن تكييفها لفحوصات لقياس الأحداث إصلاح في "الوقت الحقيقي" من خلال الكشف عن مظهر الخلايا + GFP في غضون دقائق أو ساعات بعد تحريض DSBs 2. وعلاوة على ذلك ، فإن تحليل خلايا + GFP لا تعتمد على تكاثر الخلايا إضافية ، مما يسمح بتحليل DSB إصلاح في مختلف مراحل دورة الخلية بعد العلاج بالأدوية المختلفة التي اعتقال 6 انقسام الخلايا. وهذا يوفر ميزة هامة على مراسل يبني على أساس إعادة تشكيل علامة اختيار.
عملية NHEJ هذا بحد ذاته عرضة للخطأ توليد إعادة ترتيب الصغيرة في مختلف منعطفات الغايات. الخاصية الفريدة لمراسل NHEJ لدينا هو أن الأحداث تحدث في إطار إصلاح إنترون ، والتي تتسامح مع عمليات الحذف والإدراج ، مما يتيح الكشف عن مجموعة واسعة من الأحداث NHEJ. ويستند في بناء الموارد البشرية في نفس الجين GFP بصيغته المعدلة في بناء NHEJ السماح للتحليل مقارن للNHEJ والموارد البشرية. سيتم استخدام NHEJ الفلورسنت والمقايسات HR تسهيل الدراسات إصلاح DSB الثدييات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وكان النص الأصلي GFP - Pem1 هدية من الدكتور لى لى. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الطبية لVG إليسون وAS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| pDsRed2-N1 | Clontech Laboratories | 632406 | |
| Round bottom tubes | BD Biosciences | 352058 | FACS tubes |
References
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
