Summary
Dit artikel beschrijft op basis van GFP-fluorescentie
Abstract
DNA dubbelstrengs breuken zijn de meest gevaarlijke DNA laesies die kunnen leiden tot massale verlies van genetische informatie en celdood. Cellen repareren DSB's met behulp van twee belangrijke routes: niet-homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR). Verstoringen van de NHEJ en HR worden vaak geassocieerd met vroegtijdige veroudering en het ontstaan van tumoren, daarom is het belangrijk om een kwantitatieve manier van meten elk DSB reparatie pad. Ons laboratorium heeft ontwikkeld fluorescerende reporter constructen die gevoelige en kwantitatieve meting van NHEJ en HR mogelijk te maken. De constructen zijn gebaseerd op een aangelegde GFP-gen bevat erkenning sites voor een zeldzame-cutting I-SCEI endonuclease voor inductie van DSB. Het uitgangspunt GFP constructen zijn negatief omdat het GFP-gen wordt geïnactiveerd door een extra exon, of door mutaties. Succesvolle reparatie van de I-SCEI-geïnduceerde pauze door NHEJ of HR herstelt het functionele GFP-gen. Het aantal GFP positieve cellen geteld door flowcytometrie geeft kwantitatieve meting van NHEJ of HR-efficiëntie.
Protocol
In dit protocol beschrijven we de methode voor de analyse van DNA DSB repareren met chromosomaal geïntegreerde reporter constructen 1,2 waar de DSB's zijn in vivo veroorzaakt door transiënte expressie een zeldzame cutting endonuclease I-SCEI 3. De geïntegreerde test biedt het voordeel van het analyseren van DSB repareren in de chromosomale context. Echter, dit protocol vereist langdurige cel passage, die problematisch kan zijn bij het werken met primaire cellen.
Een alternatieve benadering is een extrachromosomaal test waar de reporter constructen zijn in vitro gedigereerd met I-SCEI of Hindlll endonucleasen en vervolgens getransfecteerd in cellen als lineaire DNA. De exctrachromosomal assay protocol 4 is vergelijkbaar met de geïntegreerde test hieronder beschreven met de volgende wijzigingen. Voor de extrachromosomaal test achterwege laten van de integratie van reporter constructen en in plaats daarvan de cellen co-transfecteren met 0,5 ug van NHEJ reporterplasmide gelineariseerd in vitro met I-SCEI of HindlII en 0,1 ug van pDsRed2-N1, zoals transfectie controle. Voor de HR-test co-transfecteren 2 ug HR reporterplasmide gelineariseerd met I-SCEI of Hindlll en 0,1 pg pDsRed2-N1. Analyseer de cellen door FACS drie dagen na transfectie. De extrachromosomaal test maakt voor de analyse van DSB reparatie in primaire isolaten, zodat lange cel passage, en het vergemakkelijken van de analyse van veelvoudige cellijnen.
1. Reporter Constructen voor NHEJ en HR
De NHEJ verslaggever cassette 5 bevat een GFP-gen met een aangelegde 3 kb intron uit het Pem1 gen (GFP-Pem1). De Pem1 intron bevat een adenovirale exon geflankeerd door herkenningssequenties voor HindIII en I-SCEI endonucleasen (figuur 1a) voor de inductie van DSB. De I-SCEI sites zijn in omgekeerde richting. I-SCEI heeft een nonpalindromic herkenningssequentie, dus twee omgekeerde sites te genereren onverenigbaar DNA-uiteinden (figuur 1c). Onverenigbaar DNA-uiteinden best na te bootsen in de natuur voorkomende DSB's. De intacte NHEJ cassette is GFP negatief als de adenovirale exon de GFP ORF verstoort. Bij de inductie van DSB door I-SCEI, is de adenovirale exon verwijderd en NHEJ herstelt functie van het GFP-gen (figuur 2). Het unieke kenmerk van deze NHEJ reporter is dat het een breed spectrum van NHEJ bijwerkingen te kunnen waarnemen, omdat het intron kan verdragen deleties en inserties.
De HR-reporter cassette 1 (figuur 1b) is ook gebaseerd op de GFP-Pem1. In de HR-cassette, het eerste exon van het GFP-Pem1 bevat een 22 bp deletie in combinatie met het inbrengen van drie restrictieplaatsen, I-SceI/HindIII/I-SceI. Het verwijderen zorgt ervoor dat GFP niet kan worden opgelost door een NHEJ gebeurtenis. De twee I-SCEI sites zijn in omgekeerde richting, zodat ik-SCEI spijsvertering onverenigbare uiteinden (figuur 1c) bladeren. Het eerste exemplaar van het GFP-Pem1 wordt gevolgd door een promoter-less/ATG-less eerste exon en intron van GFP-Pem1. De intacte construct is GFP-negatief. Bij de inductie van een DSB door I-SCEI spijsvertering de functionele GFP-gen wordt gereconstitueerd door intramoleculaire of intermoleculaire genconversie tussen de twee gemuteerde kopieën van de eerste GFP-Pem1 exon. Sinds de tweede kopie van het GFP-gen ontbreekt de eerste ATG codon en het tweede exon, oversteken of single-streng gloeien zal niet herstellen van de GFP-activiteit. Dit ontwerp zorgt voor de exclusieve detectie van gen-conversie, dat is de belangrijkste HR-route in zoogdiercellen (figuur 3).
2. Integratie van de Reporter constructen in het genoom
- Maak een hoge kwaliteit voorbereiding van NHEJ of HR-reporter plasmide. Voor het beste resultaat gebruik Qiagen Endo free kit. Meten plasmide concentratie en zuiverheid door absorptie bij 260 / 280 nm.
- Lineariseren 10 ug van het reporter plasmide door verteren met 50 U van Nhel in 50 ui (totaal volume van de reactie) voor 6 uur in 37 ° C incubator (geen gebruik maken van de droge blokkeren, om verdamping te voorkomen). Zuiver DNA van de vertering oplossing met Qiagen QiaexII Kit, elueren DNA in 20 ul van 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Meten DNA-concentratie en zuiverheid door absorptie bij 260 / 280 nm. Meestal zul je 20-30% van de DNA-verliezen tijdens het zuiveringsproces. Bevestig de opbrengst en de spijsvertering door het uitvoeren van een kleine hoeveelheid (2 pl) op een gel, samen met een onverteerd reporter te bouwen. Het gezuiverde gelineariseerde reporter construct kan worden bewaard bij 20 ° C.
- Ter voorbereiding voor transfectie, breng de cellen naar de beste groeiende conditie. Als vanaf een bevroren flesje, twee keer splitsen de cellen voor transfectie. Als vanaf een plaat die confluente cellen, een keer splitsen.
- Groeien de cellen tot 70-80% confluentie (meestal twee dagen, indien verguld 5x10 5 cells/100 mm plaat, voor de normale menselijke fibroblasten). Het is van cruciaal belang voor de beste transfectie-efficiëntie om de cellen te brengen logaritmische groei. Actief aan de groei cultuur bevat cellen in de M fase (gezien als een afgeronde cellen aan het oppervlak).
- Transfect de cellen met behulp van Amaxa Nucleofector volgende aanbevelingen van de fabrikant. Voor fibroblasten gebruik NHDF oplossing en het programma U20. Voor de transfectie, de oogst van de cellen uit twee 100 mm platen (~ 2x10 6 cellen). Het is van levensbelang, niet meer dan trypsinize de cellen. Stop behandeling met trypsine zodra 80% van de cellen los van de plaat. Resuspendeer de cellen in NHDF oplossing. Cellen zijn gevoelig voor NHDF oplossing, dus het minimaliseren van de incubatietijd en meng de cellen. Transfecteren de cellen met 0,5 ug van de gelineariseerde reporter te construeren. Deze transfectie omstandigheden, in combinatie met normale menselijke fibroblasten resulteren in de integratie van een enkele kopie van een verslaggever te bouwen voor het merendeel van de integranten.
- Selecteer de cellen met chromosomaal geïntegreerde reporter constructen door toevoeging van 1 mg / ml geneticine (G418) 24 uur na transfectie. Doorgaan selectie voor 7-10 dagen.
- Kies de G418 resistente kolonies (u kunt kiezen individuele kolonies of het zwembad van de resistente klonen). Vouw de cultuur tot ongeveer vijf 100 mm platen. Freeze drie platen voor toekomstig gebruik en uitbreiden van de resterende twee platen om het gewenste aantal cellen (meestal tien 100 mm platen zijn voldoende voor vijf transfecties).
- Wanneer de cellen 70-80% confluentie (twee dagen na plateren 5x10 5 cellen per 100 mm plaat voor fibroblasten) te bereiken, de cellen zijn klaar om te worden getransfecteerd met I-SCEI uiten plasmide.
3. Inductie van DSB door de transiënte expressie van I-SCEI endonuclease
- Transfecteren ~ 2x10 6 cellen (twee platen) van logaritmisch groeiende cultuur met een mengsel van 5 pg I-SCEI uiten plasmide en 0,1 pg pDsRed2-N1 (Clontech) als een transfectie-efficiëntie controle met behulp van Amaxa Nucleofector (gebruik NHDF oplossing en U20 programma voor fibroblasten ).
- Tegelijkertijd bereiden drie calibratie controles voor FACS door trasfecting ~ 2x10 6 cellen met (i) 5 microgram EGFP-expressie plasmide, (ii) 5 microgram pDsRed2-N1, (iii) 5 ug van een controle plasmide dat niet uitdrukken een fluorescerend eiwit (we zijn met behulp van een plasmide coderend voor HPRT minigen).
- Groeien de cellen voor vier dagen de tijd om voldoende tijd te geven voor expressie van GFP en DsRed eiwitten.
- (Optioneel) Drie dagen na transfectie controleren van de efficiëntie van transfectie en expressie van GFP en DsRed eiwitten door het fluorescerende omgekeerde microscoop met filters voor de detectie van GFP en DsRed.
4. Analyse van de GFP + en DsRed + cellen door middel van flowcytometrie
- Vier dagen na transfectie oogst I-SCEI getransfecteerde cellen en de controle cellen. Resuspendeer de cellen in 500 pi PBS en transfer cellen om de FACS buizen. In dit stadium is het essentieel om alle cellen oogst en cellen van ronde vorm hebben. Om dit te bereiken, is het raadzaam om een langere behandeling met trypsine tijd of een sterkere trypsine te gebruiken. Bevestigen dat 99% van de cellen worden losgemaakt van de plaat en zijn ronde vorm door het observeren van de cellen onder de microscoop. Houd de cellen op ijs beschermd tegen licht (cover ijsemmer met folie). Het is mogelijk om de cellen op ijs op te slaan voor een paar uur. Voor de beste resultaten te analyseren van de cellen direct na de oogst.
- Kalibreren FACS met GFP, DsRed, en de negatieve controles. Pas spanning en kleur compensatie in om alle fluorescerende cellen in de analyse (figuur 4) op te nemen. Houd in gedachten dat de fluorescentie-intensiteit van de experimentele monsters lager zal zijn dan die van de controles.
- Analyseer I-SCEI getransfecteerde cellen door FACS. Wij rekenen ten minste 20.000 cellen voor elke behandeling. Om mogelijke storing tussen de GFP en DsRed fluorescentie wordt aanbevolen om het percentage van de GFP + of DsRed + cellen te houden onder de 25%. Te voorkomen Als het percentage van de DsRed + of GFP + cellen hoger is vermindering van de hoeveelheid pDsRed2-N1 of I-SCEI plasmide. In onze experimenten hebben we alleen nodig om de hoeveelheid pDsRed2-N1 plasmide te passen, maar niet van de I-SCEI plasmide.
- Het percentage van de GFP + cellen komt overeen met de efficiëntie van de DNA-reparatie en de DSB procent van de DsRed + cellen geeft aan dat de efficiëntie van de transfectie. Bereken de relatieve efficiëntie van DNA DSB herstel als de verhouding van GFP + cellen om DsRed + cellen.
- De gerepareerde einde knooppunten kunnen worden gesequenced om de juistheid van de reparatie te testen. De reporter constructen bevatten E.coli oorsprong van replicatie en kanamycine resistentie genen (figuur 1). Dit maakt het redden van de constructies door verteren genomisch DNA met EcoRI enzym, recircularization, en transformatie in competente E. coli cellen. De geredde plasmiden worden vervolgens geanalyseerd door restrictie spijsvertering en sequencing.
5. Representatieve resultaten
Typische FACS resultaten van de controle transfecties en van NHEJ en HR experimenten worden getoond in figuren 4 en 5. Fluorescentie-intensiteit en het aantal fluorescerende cellen zal lager zijn in de I-SCEI getransfecteerde cellen met het integreren vaned NHEJ en HR constructen (figuur 5) in vergelijking met de controles (figuur 4) als gevolg van het verschil in het aantal kopieën van GFP en DsRed constructen in deze cellen. Elke cel in het experiment bevat slechts een exemplaar van de geïntegreerde reporter construct, waardoor succesvolle reparatie gebeurtenissen reconstrueren de GFP-gen in een fractie van de cellen. Transfectie met 0,1 ug pDsRed2-N1 in de menselijke fibroblasten levert ongeveer een plasmide kopie per cel.
De efficiëntie van NHEJ en HR wordt berekend als een verhouding van GFP + / DsRed + cellen. NHEJ is een efficiënter proces dan HR in menselijke cellen 2. In de menselijke fibroblasten het NHEJ efficiency is typisch 0.6-1.3, en HR-efficiency is 0.05-0.3. Omdat DSB efficiency wordt gemeten als de verhouding tussen GFP + / + cellen DsRed variaties in het mengsel van I-SCEI en DsRed2-N1 plasmiden kunnen het resultaat beïnvloeden. Het plasmide kwaliteit kan ook invloed hebben op de resultaten door het veranderen van transfectie-efficiëntie. Daarom, om het verkrijgen consistente metingen, is het belangrijk om dezelfde plasmide mix te gebruiken binnen een experiment. Bovendien is de DSB reparatie efficiëntie beïnvloed door celtype, fase van de celcyclus, en de chromosomale locatie van de geïntegreerde constructen.
Figuur 1. Reporter bouwt voor de analyse van DNA-reparatie door DSB NHEJ (A) en HR (B). (C) Incompatibel DNA-uiteinden gegenereerd door vertering van twee omgekeerde I-SCEI sites van SD, splice donor; SA, splice acceptor, schaduwrijke pleinen, polyadenylatie sites; Neo / Kana, single ORF bediend door twee promotoren:. SV40 verlenen neomycine resistentie in zoogdieren cellen en β-lactamase kanamicyn weerstand in E. coli; Ori, E. Coli pUC oorsprong van replicatie.
Figuur 2. Reporter bouwen voor de analyse van NHEJ In dit construct het GFP-gen inactief is;. Maar na inductie van een DSB en succesvolle NHEJ het construct wordt GFP +. Hieronder vindt u een reparatie product van deze reporter door NHEJ.
Figuur 3. Reporter bouwen voor de analyse van HR door genconversie. Bij inductie van de DSB door I-SCEI, HR door genconversie (GC) reconstitutes een actieve GFP-gen. Hieronder worden gerepareerd producten van deze reporter door de grote DNA-reparatie wegen: GC, crossing-over (X-over), enkele streng gloeien (SSA), en NHEJ. X-over reparatie product wordt getoond voor intramoleculaire recombinatie, zal exramolecular recombinatie geven hetzelfde product, maar bevindt zich op een chromosoom. Genen actief GFP-eiwit (GFP +) zijn aangegeven met groene kleur.
Figuur 4. Kalibratie van de parameters voor de FACS-analyse. (A) fibroblasten getransfecteerd met het plasmide pHPRT, gebruikt als een negatieve controle voor het uitsluiten van auto fluorescerende cellen. (B) Fibroblasten getransfecteerd met plasmide pEGFP, gebruikt voor het instellen van de gating voor GFP + cellen (groen gebied). (C) Fibroblasten getransfecteerd met pDsRed2-N1 plasmide, gebruikt voor het instellen van de gating voor DsRed + cellen (rode gebied).
Figuur 5. Typische resultaten van de analyse van NHEJ (A) en HR (B) in normale humane fibroblasten met chromosomaal geïntegreerde reporter constructen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fluorescerende NHEJ en HR-reporter testen leveren een kwantitatieve manier voor het meten van elk afzonderlijk DSB reparatie pathway in vivo. De testen zijn zeer gevoelig, omdat FACS op betrouwbare wijze kan 10 GFP + cellen te detecteren in 20.000 cellen. De assays kan worden aangepast voor het meten van herstel gebeurtenissen in "real time" door het detecteren van de verschijning van GFP + cellen binnen enkele minuten of uren na inductie van DSB's 2. Bovendien is de analyse van de GFP +-cellen niet doen op aanvullende celproliferatie, waardoor DSB reparatie te worden geanalyseerd in verschillende stadia van de celcyclus na de behandeling met verschillende medicijnen die arrestatie celdeling 6. Dit biedt een belangrijk voordeel ten opzichte reporter constructen op basis van reconstructie van een selecteerbare merker.
Het NHEJ proces is intrinsiek foutgevoelig het genereren van verschillende kleine herschikkingen aan de uiteinden knooppunten. De unieke eigenschap van ons NHEJ reporter is dat reparatie gebeurtenissen zich voordoen binnen een intron, die deleties en inserties tolereert, waardoor de detectie van een breed spectrum van NHEJ gebeurtenissen. De HR-constructie is gebaseerd op dezelfde gewijzigde GFP-gen als de NHEJ constructie waardoor de vergelijkende analyse van NHEJ en HR. Het gebruik van fluorescerende NHEJ en HR-assays zal de studies van zoogdieren DSB reparatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De originele GFP-Pem1 was een geschenk van Dr Lei Li. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH en de Ellison Medical Foundation om VG en AS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| pDsRed2-N1 | Clontech Laboratories | 632406 | |
| Round bottom tubes | BD Biosciences | 352058 | FACS tubes |
References
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
