L'analyse de l'ADN double-brin Break (ORD) de réparation dans les cellules de mammifères

Summary

Cet article décrit la GFP basée sur la fluorescence

Abstract

L'ADN des cassures double brin sont les lésions de l'ADN le plus dangereux qui peuvent conduire à une perte massive de l'information génétique et la mort cellulaire. CDB à réparer les cellules en utilisant deux voies principales: la fin non homologues (NHEJ) et la recombinaison homologue (RH). Perturbations du NHEJ et RH sont souvent associés au vieillissement prématuré et la tumorigenèse, il est donc important d'avoir un moyen quantitatif de la mesure de chaque voie de réparation ORD. Notre laboratoire a développé des constructions rapporteurs fluorescents qui permettent de mesurer sensible et quantitative du NHEJ et RH. Les constructions sont basées sur un gène de la GFP conçu contenant des sites de reconnaissance pour une rare coupe I-Scel endonucléase pour l'induction de CDB. Les constructions de départ sont GFP négatifs comme le gène de la GFP est inactivé par un exon supplémentaire, ou par des mutations. Réparation réussie des pauses I-Scel induite par NHEJ ou HR restaure le gène de la GFP fonctionnelle. Le nombre de cellules GFP-positives comptées par cytométrie en flux permet une mesure quantitative du NHEJ ou l'efficacité des ressources humaines.

Protocol

Dans ce protocole, nous décrivons la méthode pour l'analyse de l'ADN ORD réparation avec le journaliste chromosomique intégrés construit ^1,2, où CDB sont induites in vivo par expression transitoire d'une endonucléase de coupe rares I-Scel ^3. Le test intégré offre l'avantage de l'analyse de réparation des CDB dans le contexte chromosomique. Cependant, ce protocole nécessite cellulaire prolongée repiquage, ce qui peut être problématique lorsque l'on travaille avec des cellules primaires.

Une approche alternative est un test où les constructions rapporteurs extrachromosomique sont digérées in vitro avec I-Scel ou endonucléases HindIII et ensuite transfectés dans des cellules sous forme d'ADN linéaire. Le protocole de dosage exctrachromosomal ⁴ est similaire à l'essai décrit ci-dessous intégrées avec les modifications suivantes. Pour le dosage extrachromosomique omettre l'intégration des constructions rapporteurs et au lieu de co-transfecter des cellules avec 0,5 ug de plasmide rapporteur linéarisé NHEJ in vitro avec I-Scel ou HindIII et 0,1 ug de pDsRed2-N1 que le contrôle de la transfection. Pour le dosage de la co-transfecter HR 2 HR Reporter ug de plasmide linéarisé avec I-Scel ou HindIII et 0,1 pg pDsRed2-N1. Analyser les cellules par FACS, trois jours après la transfection. Le test extrachromosomique permet l'analyse de la réparation ORD dans des isolats primaires, en évitant la cellule vaste repiquage, et de faciliter l'analyse des lignées cellulaires multiples.

1. Construit Reporter pour NHEJ et RH

La cassette journaliste NHEJ ⁵ contient un gène de la GFP avec une conçues intron 3 kb du gène Pem1 (GFP-Pem1). L'intron Pem1 contient un exon adénoviraux flanqué par des séquences de reconnaissance pour des endonucléases HindIII et I-Scel (figure 1a) pour l'induction de CDB. Les sites I-Scel sont en orientation inversée. I-Scel a une séquence de reconnaissance nonpalindromic, où deux sites inversé générer des extrémités d'ADN incompatibles (figure 1c). L'ADN incompatibles se termine mieux imiter la CDB d'origine naturelle. La cassette intacte NHEJ est négatif comme la GFP de l'exon adénoviraux perturbe l'ORF GFP. Après l'induction de CDB par I-Scel, l'exon adénovirale est enlevé et NHEJ restaure la fonction du gène de la GFP (figure 2). La caractéristique unique de ce journaliste NHEJ est qu'il peut détecter un large spectre de manifestations depuis le NHEJ intron peut tolérer les suppressions et les insertions.

La cassette HR Reporter ¹ (figure 1b) est également basé sur la GFP-Pem1. Dans la cassette RH, le premier exon du GFP-Pem1 contient une délétion 22 pb combiné avec l'insertion de trois sites de restriction, I-SceI/HindIII/I-SceI. La suppression assure que la GFP ne peut être reconstitué par un événement NHEJ. Les deux I-Scel sites sont en orientation inversée, de sorte que I-Scel la digestion feuilles fins incompatibles (figure 1c). Le premier exemplaire de la GFP-Pem1 est suivie par une promoter-less/ATG-less premier exon et l'intron de GFP-Pem1. La construction est intacte GFP-négatifs. Après induction d'un ORD par I-Scel la digestion du gène de la GFP fonctionnelle est reconstitué par conversion génique intramoléculaire ou intermoléculaire entre les deux copies mutées de la première GFP-Pem1 exon. Depuis la seconde copie du gène de la GFP est manquant du premier codon ATG et le second exon, traversant ou simple-brin de recuit ne restaure pas l'activité la GFP. Cette conception permet la détection exclusive de conversion génique, qui est la voie RH prédominante dans les cellules de mammifères (figure 3).

2. Intégration des constructions rapporteurs dans le génome

1. Faire une préparation de haute qualité NHEJ ou reporter RH plasmide. Pour de meilleurs résultats Qiagen Endo libres Bluetooth. Mesurer la concentration et la pureté plasmidique par absorbance à 260/280 nm.
2. Linéariser 10 ug de plasmide rapporteur en digérant avec 50 U d'Nhel dans 50 ul (volume total de la réaction) pendant 6 heures à 37 ° C incubateur (ne pas utiliser le bloc sec, pour éviter l'évaporation). Purifier l'ADN de la solution de digestion avec Qiagen QiaexII Kit, l'ADN éluer dans 20 ul de 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Mesurer la concentration d'ADN et de la pureté par absorbance à 260/280 nm. Habituellement, vous allez perdre 20-30% de l'ADN lors de la purification. Confirmer le rendement et la digestion en exécutant une petite aliquote (2 ul) sur un gel, avec un journaliste non digérées construire. La construction journaliste purifiée linéarisée peut être conservé à 20 ° C.
3. En préparation pour la transfection, amener les cellules à la meilleure condition de croissance. Si à partir d'un flacon congelé, fractionner les cellules deux fois avant la transfection. Si à partir d'une plaque de cellules confluentes, les diviser une seule fois.
4. Cultivez les cellules à 70-80% de confluence (généralement deux jours, si plaqués 5x10 ⁵ cellules/100 plaque de mm, pour des fibroblastes humains normaux). Il est essentiel pour la meilleure efficacité de la transfection d'apporter les cellules en croissance logarithmique. Culture en croissance active contient des cellules en phase M (considéré comme des cellules arrondies attachées à la surface).
5. Transfect les cellules en utilisant les recommandations du fabricant Amaxa suivantes Nucleofector est. Pour utiliser la solution de fibroblastes NHDF et U20 programme. Pour la transfection, la récolte des cellules provenant de deux plaques de 100 mm (~ 2x10 ⁶ cellules). Il est essentiel de ne pas trop trypsiniser les cellules. Arrêtez dès que trypsinisation de 80% des cellules détachées de la plaque. Resuspendre les cellules dans une solution de NHDF. Les cellules sont sensibles à la solution de NHDF, par conséquent, de minimiser le temps d'incubation et mélanger délicatement les cellules. Transfecter des cellules avec 0,5 pg de construire journaliste linéarisé. Ces conditions de transfection, lorsqu'il est utilisé avec des fibroblastes humains normaux résulte de l'intégration d'un seul exemplaire d'un journaliste de construire pour la majorité des intégrants.
6. Sélectionnez les cellules avec des constructions rapporteurs chromosomique intégrés en ajoutant 1 mg / mL généticine (G418) 24h après la transfection. Continuer de sélection pour les 7-10 jours.
7. Choisissez les colonies résistantes au G418 (vous pouvez choisir des colonies individuelles ou à la piscine les clones résistants). Développer la culture d'environ cinq plaques de 100 mm. Gel de trois plaques pour une utilisation future et d'élargir les deux autres plaques de la cellule numéro désiré (généralement dix plaques de 100 mm sont suffisants pendant cinq transfections).
8. Lorsque les cellules atteignent 70-80% de confluence (deux jours après l'étalement 5x10 ⁵ cellules par plaque de 100 mm pour les fibroblastes), les cellules sont prêtes à être transfectées avec I-Scel plasmide exprimant.

3. L'induction de l'ORD par expression transitoire d'I-Scel Endonucléase

1. Transfecter ~ 2x10 ⁶ cellules (deux plateaux) de la culture logarithmique croissante avec un mélange de 5 ug I-Scel plasmide exprimant et 0,1 mg pDsRed2-N1 (Clontech) comme un contrôle de l'efficacité de transfection utilisant Amaxa Nucleofector (utiliser la solution de NHDF et U20 du programme pour les fibroblastes ).
2. Dans le même temps de préparer trois contrôles d'étalonnage pour FACS par trasfecting ~ 2x10 ⁶ cellules avec (i) 5 ug EGFP-plasmide exprimant, (ii) 5 ug pDsRed2-N1, (iii) 5 ug d'un plasmide contrôle qui n'exprime pas une fluorescent protein (nous utilisons un plasmide codant HPRT minigène).
3. Cultiver les cellules pendant quatre jours pour donner suffisamment de temps pour l'expression de la GFP et les protéines DsRed.
4. (Facultatif) Trois jours après la transfection de vérifier l'efficacité de la transfection et l'expression de la GFP et les protéines fluorescentes DsRed par microscope inversé avec des filtres pour la détection de la GFP et DsRed.

4. Analyse de la GFP + + et les cellules DsRed par cytométrie en flux

1. Quatre jours après la transfection de récolte I-Scel cellules transfectées et les cellules de contrôle. Resuspendre les cellules dans 500 ul de PBS et de transfert de cellules pour les tubes FACS. A ce stade, il est essentiel de récolter toutes les cellules et les cellules ont une forme ronde. Pour y parvenir, il est recommandé d'utiliser un plus long temps trypsinisation ou une plus forte trypsine. Confirmez que 99% des cellules sont détachés de la plaque et ont une forme ronde par l'observation des cellules au microscope. Gardez les cellules sur la glace abri de la lumière (couverture seau à glace avec une feuille). Il est possible de stocker les cellules sur la glace pendant quelques heures. Pour les meilleurs résultats d'analyser les cellules immédiatement après la récolte.
2. Calibrer FACS avec la GFP, DsRed, et les contrôles négatifs. Ajustez la tension et compensation de couleur afin d'inclure toutes les cellules fluorescentes dans l'analyse (figure 4). Gardez à l'esprit que l'intensité de fluorescence des échantillons expérimentaux seront plus bas que celui des contrôles.
3. Analyser I-Scel cellules transfectées par FACS. Nous comptons au moins 20.000 cellules pour chaque traitement. Pour éviter les interférences possibles entre la GFP et DsRed de fluorescence, il est recommandé de garder le pour cent de la GFP + ou + DsRed cellules en dessous de 25%. Si le pourcentage de + DsRed ou GFP + cellules est supérieure réduire la quantité de pDsRed2-N1 ou I-Scel plasmide. Dans nos expériences nous avons seulement besoin d'ajuster la quantité de pDsRed2-N1 plasmide, mais pas du plasmide I-Scel.
4. Le pour cent des cellules GFP + correspond à l'efficacité de l'ADN et la réparation de l'ORD pour cent des cellules + DsRed indique l'efficacité de la transfection. Calculer l'efficacité relative de l'ADN ORD réparation comme le ratio de cellules GFP + + aux cellules DsRed.
5. Les jonctions fin réparées peuvent être séquencés pour tester l'exactitude de réparation. Les constructions rapporteurs contiennent l'origine de réplication et de E. coli des gènes de résistance à la kanamycine (figure 1). Cela permet le sauvetage des constructions en digérant l'ADN génomique avec enzyme EcoRI, recircularisation, et leur transformation en cellules E. coli compétentes. Les plasmides secourus sont ensuite analysés par digestion de restriction et séquençage.

5. Les résultats représentatifs

Les résultats typiques de FACS des transfections de contrôle et de la NHEJ et expériences RH sont illustrés aux figures 4 et 5. Intensité de fluorescence et le nombre de cellules fluorescentes sera plus faible dans les cellules transfectées I-Scel contenant intéed NHEJ et construit RH (figure 5) par rapport aux témoins (figure 4) en raison de la différence dans le nombre de copies de la GFP et les constructions DsRed dans ces cellules. Chaque cellule de l'expérience ne contient qu'un seul exemplaire de la construction rapporteur intégré, les événements de réparation ainsi retenus seront reconstituer le gène de la GFP dans une fraction des cellules. Transfection avec 0,1 pg pDsRed2-N1 dans des fibroblastes humains délivre environ 1 copies du plasmide par cellule.

L'efficacité de la NHEJ et RH est calculé comme le rapport de la GFP + / DsRed + cellules. NHEJ est un processus plus efficace que dans les cellules humaines RH ^2. Dans les fibroblastes humains de l'efficacité est généralement de 0,6 à 1,3 NHEJ, et l'efficacité des ressources humaines est de 0,05 à 0,3. Depuis l'efficacité ORD est mesurée comme un rapport de la GFP + / DsRed + variations des cellules dans le mélange de I-Scel et DsRed2-N1 plasmides peuvent affecter le résultat. La qualité plasmide peut également affecter les résultats en changeant efficacité de la transfection. Par conséquent, pour obtenir des mesures cohérentes, il est important d'utiliser la même combinaison au sein d'un plasmide expérience. Par ailleurs, l'efficacité de réparation ORD est affectée par le type cellulaire, phase du cycle cellulaire et localisation chromosomique des constructions intégrées.

Figure 1. Reporter construit pour l'analyse de l'ADN ORD réparation par NHEJ (A) et HR (B). (C) l'ADN incompatibles extrémités générées par la digestion de deux inversé les sites I-Scel SD, d'épissage donneur; SA, accepteur d'épissage; places ombragées, des sites de polyadénylation; Neo / Kana, seule ORF contrôlée par deux promoteurs:. SV40 résistance à la néomycine conférant au mammifères cellules, et β-lactamase conférant la résistance kanamicyn dans E. coli; Ori, E. L'origine de réplication pUC Coli.

Figure 2. Reporter construire pour l'analyse de la NHEJ Dans cette construction du gène de la GFP est inactif;. Mais lors de l'induction d'une NHEJ ORD et réussi la construction devient GFP +. Ci-dessous est un produit de réparation de ce journaliste par NHEJ.

Figure 3. Reporter de construire pour l'analyse des RH par conversion génique. Après l'induction de la CDB par I-Scel, RH par le gène de conversion (CG) reconstitue un gène GFP active. Ci-dessous sont des produits de réparation de ce journaliste par les principales voies de réparation d'ADN: GC, crossing-over (X-over), seul brin de recuit (ASS), et NHEJ. Produit de réparation X-over est montrée pour la recombinaison intramoléculaire, la recombinaison exramolecular donnera le même produit, mais situé sur un chromosome. Des gènes exprimant une protéine GFP active (GFP +) sont indiqués par la couleur verte.

Figure 4. Calibrage des paramètres pour l'analyse FACS (A). Fibroblastes transfectés avec le plasmide pHPRT, utilisées comme contrôle négatif de l'exclusion automatique des cellules fluorescentes. (B) fibroblastes transfectés avec le plasmide pEGFP, utilisé pour le réglage du gating pour les cellules GFP + (zone verte). (C) fibroblastes transfectés avec le plasmide pDsRed2-N1, utilisé pour le réglage du gating pour les cellules + DsRed (zone rouge).

Figure 5. Les résultats typiques de l'analyse de NHEJ (A) et RH (B) dans des fibroblastes humains normaux avec des constructions rapporteurs chromosomique intégré.

Discussion

Les fluorescents NHEJ et analyses HR Reporter fournir un moyen quantitatif pour mesurer séparément chaque voie de réparation ORD in vivo. Les tests sont très sensibles, comme FACS peut détecter de façon fiable 10 cellules GFP + dans 20.000 cellules. Les dosages peuvent être adaptés pour mesurer des événements de réparation en "temps réel" en détectant l'apparition de cellules GFP + dans les minutes ou heures après l'induction de CDB ^2. Par ailleurs, l'analyse de cellules GFP + ne repose pas sur la prolifération des cellules supplémentaires, permettant la réparation ORD pour être analysés à différents stades du cycle cellulaire après le traitement avec des médicaments différents que la division cellulaire d'arrestation ^6. Cela fournit un avantage important par rapport constructions rapporteurs basées sur la reconstitution d'un marqueur sélectionnable.

Le processus de NHEJ est intrinsèquement sujettes aux erreurs générant différents réarrangements petits bouts aux jonctions. La propriété unique de notre journaliste NHEJ est que les événements se produisent dans la réparation d'un intron, qui tolère les suppressions et les insertions, permettant ainsi la détection d'un large éventail d'événements NHEJ. La construction de RH est basée sur le gène de la GFP modifiées même que le NHEJ de construire permettant l'analyse comparative de NHEJ et RH. L'utilisation de fluorescents NHEJ et tests RH facilitera les études de l'ORD de réparation chez les mammifères.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EndoFree Plasmid Maxi kit	Qiagen	12362
Qiaex II Gel Extraction Kit	Qiagen	20021
Amaxa Nucleofector	Lonza Inc.	AAD-1001
Geneticin (G418)	Invitrogen	11811-031
pDsRed2-N1	Clontech Laboratories	632406
Round bottom tubes	BD Biosciences	352058	FACS tubes