Summary
本文介绍了基于GFP的荧光
Abstract
DNA双链断裂是最危险的DNA损伤，可能会导致遗传信息和细胞死亡的大量流失。使用两个主要途径：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）的细胞修复DNA双链断裂。 NHEJ能和人力资源的扰动往往与过早衰老和肿瘤的发生相关，因此重要的是有一个定量的方式测量每个DSB修复途径。我们的实验室已开发出荧光记者构造，使敏感和NHEJ能和人力资源的定量测量。是基于一个精心设计的绿色荧光蛋白含有一种罕见的切割我SCEI内切酶，DNA双链断裂感应识别位点的基因构造。开始构造的GFP负，作为额外的外显子的绿色荧光蛋白基因灭活，或突变。我SCEI诱导休息NHEJ或HR的成功修复，恢复功能的绿色荧光蛋白基因。流式细胞仪计数GFP阳性细胞的数量提供NHEJ或人力资源效率的定量测量。
Protocol
在这个协议中，我们描述了与染色体综合记者的方法构造 1,2双链断裂在体内诱导瞬时表达一种罕见的切割核酸内切酶的I - SCEI 3分析DNA DSB修复。综合检测分析染色体范围内DSB的修复提供了优势。然而，该协议要求延长细胞传代，这可能是问题时，与原电池的工作。
另一种方法是记者构造在体外消化与I - SCEI或HindIII位内切酶，然后转成线性DNA细胞染色体外检测。 4 exctrachromosomal检测协议是类似于下面描述的以下修改综合检测。对于染色体外检测省略记者结构的整合，而是合作与0.5微克NHEJ 记者在体外我SCEI或HindIII和0.1微克pDsRed2 - N1转染控制的线性质粒转染的细胞。对于人力资源检测联合转染2微克的人力资源报告质粒线性与我SCEI或HindIII和0.1微克pDsRed2 - N1。转染后3天用流式细胞仪分析细胞。染色体外检测允许分析DSB的修复初级分离，避免广泛的细胞传代，并促进多种细胞系的分析。
1。记者NHEJ能和人力资源结构
NHEJ记者卡带5包含了一个精心设计的3 kb的内含子从Pem1基因（GFP - Pem1）的绿色荧光蛋白基因。 Pem1内含子包含一个腺病毒介导的外显子，两侧为内切酶HindIII和我的SCEI诱导双链断裂（图1a）识别序列。我SCEI网站倒置方向。我SCEI有nonpalindromic识别序列，因此两个倒网站产生不兼容的DNA末端（图1c）。不相容的DNA末端的最佳模仿自然发生的DNA双链断裂。完整的NHEJ卡带是负的绿色荧光蛋白为腺病毒介导的外显子，扰乱了GFP的ORF。当我SCEI双链断裂的诱导，腺病毒介导的外显子和NHEJ能恢复功能的绿色荧光蛋白基因（图2）。本NHEJ记者的独特之处在于它可以检测广泛的NHEJ事件，因为内含子可以容忍的缺失和插入。
也是基于GFP - Pem1人力资源记者纸盒1（图1b）。在人力资源磁带，第一外显子的GFP - Pem1包含22 bp缺失与插入三个酶切位点，I-SceI/HindIII/I-SceI相结合。删除确保绿色荧光蛋白不能重组NHEJ事件。两个I - SCEI网站倒方向，使我SCEI消化叶不相容的两端（图1c）。其次是一个promoter-less/ATG-less第一外显子和内含子的GFP - Pem1 GFP - Pem1的第一个副本。完整的构造是GFP阴性。当一个DSB诱导的I - SCEI消化功能的绿色荧光蛋白基因重组GFP - Pem1第一外显子突变的两个副本之间的分子内或分子间的基因转换。由于绿色荧光蛋白基因的第二个副本是缺乏的第一个ATG密码子和第二外显子，交叉或单链退火不会恢复GFP活动。这种设计可实现基因转换的独家发现，这是在哺乳动物细胞中的主要人力资源的途径（图3）。
2。记者整合到基因组构造
- 制作高质量的质粒NHEJ或HR记者准备。为了达到最佳效果，请使用Qiagen公司的远藤免费包。在260/280 nm处测量吸光度质粒的浓度和纯度。
- 10微克的记者质粒线性化消化50 U NheI在50μL（总体积的反应）为6小时37 ° C培养箱（不使用干块，以防止蒸发）。净化消化解决方案Qiagen公司QiaexII包，到20μL10毫米的Tris - HCl pH值8.0洗脱DNA的DNA。测量DNA的浓度和纯度在260/280 nm的吸光度。通常情况下，你将失去20％至30％的DNA在纯化过程中。确认连同未消化的记者构造，凝胶上运行一个小等份（2μL）的产量和消化。纯化的线性记者构造，可以储存在20 ° C
- 在准备进行转染，使细胞的最佳生长状况。如果从一个冷冻小瓶开始，分裂细胞转染前的两倍。 ，如果从一盘的融合细胞开始，他们一次分裂。
- 增长70-80％汇合时（通常是两天，如果镀5X10 5 cells/100毫米钢板，正常的人成纤维细胞）的细胞。它是带入对数生长期的细胞的最佳转染效率的关键。积极日益增长的文化包含在M期细胞（被视为附着在表面的圆形细胞）。
- TRANSFECT的细胞，使用Amaxa Nucleofector以下制造商的建议。对于成纤维细胞，使用NHDF的解决方案和计划U20。用于转染，收获两个100毫米板（〜2 × 10 6细胞）的细胞。这是不超过trypsinize细胞的关键。停止胰蛋白酶尽快脱离板细胞的80％。在NHDF溶液重悬细胞。细胞是敏感NHDF解决方案，因此，最大限度地减少孵育时间，并轻轻混合细胞。转染的细胞，用0.5微克的线性记者构造。这些转的条件下，当正常的人成纤维细胞在一个单拷贝记者整合的结果构造为广大的integrants。
- 选择加入1毫克/毫升geneticin（G418）24小时转染后的细胞与染色体综合记者结构。继续选择7-10天。
- 挑选G418抗性克隆（你可以选择单独的殖民地或池抗性克隆）。约5个100毫米板展开的文化。冻结三个板块供日后使用，其余的两个板块展开所需的细胞数（通常是10个100毫米板足够的五个转染）。
- 当细胞达到70-80％汇合（两天后电镀5X10 5％100毫米板为成纤维细胞的细胞），我SCEI表达质粒转染细胞准备。
3。 DSB的瞬时表达我的SCEI内切酶的诱导
- 转染〜2 × 10 6细胞（两个板块）对数增长与文化的表达质粒转染效率使用Amaxa Nucleofector（使用成纤维细胞NHDF解决方案和U20程序的控制和0.1微克pDsRed2 - N1（Clontech公司）的混合物5微克的I - SCEI ）。
- 同时准备三个校准控制为流式细胞仪trasfecting与（i）〜2 × 10 6细胞5微克的EGFP表达质粒;（二）5微克pDsRed2 - N1;（三）5微克的控制质粒，并没有表达出荧光蛋白（我们使用的是HPRT小基因质粒编码）。
- 成长为4天的细胞提供足够的时间表达GFP和DsRed的蛋白质。
- （可选）三天后转验证转染GFP和DsRed的蛋白的表达，荧光倒置显微镜检测GFP和DsRed的过滤器的效率。
4。流式细胞仪分析了GFP +和DsRed的+细胞
- 四天后，转染收获我的SCEI转染细胞和对照细胞。在500μL的PBS重悬的细胞和细胞转移流式细胞仪管。在这个阶段，关键是收获的所有细胞，并有圆形细胞。为了实现这一目标，建议使用较长的胰蛋白酶消化时间或更强的胰蛋白酶。确认，99％的细胞是从板块分离，并通过显微镜下观察细胞的圆形。保持避光冰细胞（盖用铝箔的冰水桶）。它可以存储在冰上几个小时的细胞。最好的结果，分析后，立即收获细胞。
- 校准与GFP，DsRed的，与阴性对照流式细胞仪。调整电压和色彩补偿，以包括所有在分析荧光的细胞（图4）。请记住，将实验样品的荧光强度比对照低。
- 分析我的SCEI转染细胞的流式细胞仪。我们每次治疗至少20,000细胞计数。为了防止潜在干扰GFP和荧光DsRed的建议是，保持低于25％％的GFP +或DsRed的+细胞。如果DsRed的+或GFP +细胞的百分比较高，减少pDsRed2 - N1或I - SCEI质粒量。在我们的实验中，我们只需要调整的金额pDsRed2 - N1质粒，但不是我SCEI质粒。
- ％对应的GFP +细胞的DNA DSB修复的效率和DsRed的+细胞的百分比表示的转染效率。 DsRed的+细胞的GFP +细胞的比例，计算DNA DSB修复的相对效率。
- 修复结束路口可测序测试修复的准确性。记者构造含有大肠杆菌原产地复制和卡那霉素抗性基因（图1）。这使抢救消化基因组DNA，用EcoRI酶，重新环，并到主管的大肠杆菌细胞转化结构。获救的质粒酶切和测序分析。
5。代表性的成果
典型的流式细胞仪的控制转染和NHEJ能和人力资源实验结果显示在图4和5。我SCEI转染细胞含有integrat荧光强度和荧光细胞的数量将会降低ED NHEJ能和人力资源结构（图5）相比，对照组（图4）由于在绿色荧光蛋白在这些细胞中DsRed的构造的拷贝数的差异。在实验中的每个单元格只包含一个集成的记者兴建的副本，从而成功修复的事件将重组绿色荧光蛋白基因在细胞的一小部分。 0.1微克，人成纤维细胞pDsRed2 - N1转染提供了大约1％细胞的质粒拷贝。
NHEJ能和人力资源的效率的GFP + / DsRed的+细胞的比例计算。 NHEJ是一个比人力资源更有效地在人类细胞中的过程2。在人类成纤维细胞的NHEJ效率通常是0.6-1.3，和人力资源的效率是0.05-0.3。由于DSB的效率是衡量一个比例的GFP + / DsRed的+我的SCEI和DsRed2 - N1质粒的混合物细胞的变化可能会影响结果。质粒的质量也可能通过改变转染效率影响的结果。因此，要取得一致的测量，重要的是在一项实验中使用相同的质粒组合。此外，DSB修复效率的影响类型的细胞，细胞周期，染色体定位和综合结构。
图1。记者构造NHEJ（A）和HR（二）分析DNA DSB修复。 （三）不兼容的DNA两端两个倒我SCEI网站消化所产生的SD，拼接捐助; SA，剪接受体;阴影广场，聚腺苷酸化的网站;新/假名，单一的ORF由两个启动子控制：SV40赋予新霉素抗性哺乳动物。细胞和β-内酰胺酶在大肠杆菌赋予kanamicyn阻力;大利，E.大肠杆菌临市局原产地复制。
图2。记者NHEJ分析 ，在此兴建构建绿色荧光蛋白基因处于非活动状态，但经诱导的DSB成功NHEJ构建成为GFP + 。下面显示的是一个由NHEJ记者修复产品。
图3。记者构建的人力资源，通过基因转换分析 。基因转换（GC）后诱导的DNA双链断裂，人力资源由I - SCEI重组活跃的绿色荧光蛋白基因。如下图所示是主要的DNA修复途径修复产品记者：GC，过境超过（X - OVER），单链退火（SSA）的，和NHEJ。 X - OVER修复产品是分子内重组，exramolecular重组将给予同样的产品，但位于一条染色体上。基因表达活跃的绿色荧光蛋白（GFP）是由绿色表示。
图4。流式细胞仪分析参数的校准（一）成纤维细胞与pHPRT质粒转染，不包括汽车荧光细胞作为阴性对照。 （二）成纤维细胞转染pEGFP质粒，用于设置浇注的GFP +细胞（绿色区域）。 （三）成纤维细胞转染pDsRed2 - N1质粒DsRed的+细胞（红色区域）设置的门控。
图5。典型NHEJ（A）和HR（二）在正常的人成纤维细胞与染色体整合的记者构造的分析结果。
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Discussion
荧光NHEJ和HR记者分析提供定量的方式，分别测量每个DSB修复途径在体内。检测是非常敏感，流式细胞仪能够可靠地检测到10个GFP +细胞在20000细胞。检测可用于测量通过检测的GFP +细胞在几分钟之内或双链断裂2诱导后小时的外观在“实时”的修复事件改编。此外，分析的GFP +细胞不依赖于其他细胞的增殖，使DSB的修复将在不同的细胞周期的各个阶段进行分析后，与各种药物的治疗， 逮捕细胞分裂6。这提供了一个重要的优势基础上重组选择标记的记者构造，。
NHEJ过程本质上是容易出错的生成各种小重排在两端路口。我们NHEJ记者的独特属性，维修事件发生在一个内含子，容忍的缺失和插入，从而使检测的广泛NHEJ事件。人力资源结构是基于相同的修改后的GFP基因的NHEJ构造允许NHEJ能和人力资源的比较分析。使用荧光NHEJ能和人力资源分析，将有助于哺乳动物DSB修复的研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
原GFP - Pem1李磊博士的礼物。这项工作是由从美国国立卫生研究院和埃利森医学基金会VG的赠款和支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| pDsRed2-N1 | Clontech Laboratories | 632406 | |
| Round bottom tubes | BD Biosciences | 352058 | FACS tubes |
References
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- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
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