Summary
Bu makale, GFP tabanlı floresan açıklar
Abstract
DNA çift iplikli sonları büyük kaybı genetik bilgi ve hücre ölümüne yol açabilecek en tehlikeli DNA lezyonlar. Hücreler onarım DSBs katılmanın nonhomologous sonunda (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR): iki ana yollar kullanarak. NHEJ ve İK pertürbasyonlarının genellikle erken yaşlanma ve tümörogenez ile ilişkili, dolayısıyla her DSB onarım yolu ölçme nicel bir şekilde olması önemlidir. Laboratuvarımız NHEJ ve İK hassas ve kantitatif ölçümüne olanak floresan muhabiri yapıları geliştirmiştir. Yapıları DSBs indüksiyonu için nadir bir kesme-SCEI endonükleaz tanınması siteleri içeren bir mühendislik, GFP geninin dayanmaktadır. Ek bir ekson GFP geninin inaktive veya mutasyonlarla olduğu gibi başlangıç yapıları GFP negatif. NHEJ veya İK I-SCEI indüklenen sonlarının Başarılı onarım fonksiyonel GFP genini geri yükler. Flow sitometri sayılır GFP pozitif hücrelerin sayısı NHEJ kantitatif ölçü veya İK verimliliği sağlar.
Protocol
Bu protokol DSBs geçici ifade nadir bir kesim endonükleaz I-SCEI 3 in vivo olarak indüklenen 1,2 yapıları kromozomal olarak entegre muhabiri ile DNA DSB onarım analizi için bir yöntem tarif. Entegre test DSB kromozomal kapsamında onarım analiz avantaj sağlar. Ancak, bu protokol birincil hücreleri ile çalışırken sorunlu olabilir Pasajlanması uzun süreli hücre, gerektirir.
Alternatif bir yaklaşım muhabiri yapıları I-SCEI veya HindIII endonükleaz ile in vitro sindirilir ve daha sonra lineer DNA hücrelerine transfekte ekstrakromozomal testtir . Exctrachromosomal tahlil protokol 4 aşağıdaki değişiklikler aşağıda açıklanan entegre tahlil benzer. Ekstrakromozomal tahlil entegrasyon muhabiri yapıları ihmal ve hücrelerin yerine I-SCEI veya HindIII ve transfeksiyon kontrolü olarak pDsRed2-N1 0.1 mikrogram ile in vitro lineerleştirilmiş plazmid NHEJ muhabiri 0.5 mikrogram ile co-transfect için. İK testi için plazmid ortak transfect 2 mikrogram İK muhabiri I-SCEI veya HindIII ve 0.1 mg pDsRed2-N1 ile lineerleştirilmiş. Transfeksiyon sonra FACS üç gün hücrelerin analiz edin. Ekstrakromozomal testi Pasajlanması geniş hücre kaçınarak, ve birden fazla hücre hatları analizi kolaylaştırmak, analiz için birincil izolatlarında DSB onarım sağlar.
1. Muhabir oluşturur NHEJ ve İK
NHEJ muhabiri kaset 5 Pem1 gen (GFP-Pem1) bir mühendislik 3 kb intron ile GFP geninin içerir. Pem1 intron DSBs indüksiyonu için HindIII ve I-SCEI endonükleaz (Şekil 1a) tanınması dizileri ile çevrili bir adenoviral ekzon içerir. I-SCEI siteleri ters yönde. I-SCEI nonpalindromic bir tanıma dizisi, dolayısıyla iki ters siteleri uyumsuz DNA biter (Şekil 1c) üretir. Uyumsuz DNA en iyi doğal olarak meydana gelen DSBs taklit sona erer. Sağlam NHEJ kaset adenoviral ekson GFP ORF bozar gibi negatif GFP. I-SCEI DSBs indüksiyonu üzerine, adenoviral ekson kaldırılır ve NHEJ GFP geninin fonksiyonu (Şekil 2) geri yükler. Bu NHEJ muhabiri benzersiz özellik intron silme ve eklemeler tolere edebilir NHEJ olayların geniş bir yelpazede algılayabilir.
İK muhabiri kaset 1 (Şekil 1b), GFP-Pem1 dayanmaktadır . İK kaset, GFP-Pem1 ilk ekson üç kısıtlama siteleri, I-SceI/HindIII/I-SceI ekleme ile birlikte 22 bp silinmesini içeriyor. Silinmesi, GFP bir NHEJ olay tarafından sulandırılmış olamaz sağlar. Iki I-SCEI siteleri böylece I-SCEI sindirim uyumsuz uçları bırakır (Şekil 1c), ters yönde. GFP-Pem1 ilk kopyası GFP-Pem1 promoter-less/ATG-less ilk ekzon ve intron tarafından takip edilmektedir. Sağlam inşa GFP-negatif. I-SCEI sindirim DSB indüksiyon üzerine fonksiyonel GFP genini ilk GFP-Pem1 ekson mutasyona uğramış iki kopya arasında molekül veya moleküller arası gen dönüşümü ile sulandırılmış. GFP geninin ikinci kopya, ilk ATG kodon ve ikinci ekson eksik gecicek ya da tek iplikli tavlama olduğundan GFP faaliyeti geri olmayacaktır. Bu tasarım, memeli hücrelerinde baskın İK yolu (Şekil 3) gen dönüşüm özel algılama, sağlar.
2. Muhabir Entegrasyonu Genom içine oluşturur.
- NHEJ veya İK muhabiri plazmid yüksek kalitede bir hazırlık olun. En iyi sonuçlar Qiagen Endo Ücretsiz Kiti kullanımı içindir. 260/280 nm'de absorbans plazmid konsantrasyonu ve saflık ölçün.
- 50 ul NheI (reaksiyon toplam hacmi 50 U) 6 saat 37 ile sindirerek plazmid muhabiri 10 mikrogram Linearize ° C inkübatör (buharlaşmasını önlemek için, kuru blok kullanmayın). Qiagen QiaexII Takımı, 10 mM Tris-HCl pH: 8.0 20 ul içine Zehir DNA sindirimi çözüm DNA arındırın. 260/280 nm'de absorbans DNA konsantrasyonu ve saflık ölçün. Genellikle, arıtma sırasında DNA'nın% 20-30 kaybedersiniz. Sindirilmemiş bir muhabir inşa ile birlikte bir jel üzerinde küçük bir kısım (2 ul) çalışan verim ve sindirim, onaylayın. Saflaştırılmış Lineerleştirilmiş muhabiri yapı 20 ° C'de saklanabilir.
- Transfeksiyon hazırlık, hücrelerin en iyi büyüyen durumuna getirmek. Eğer donmuş bir şişeden başlangıç, transfeksiyon önce iki kez hücrelere bölünmüş. Konfluent hücrelerinin bir tabak başlayarak, bir kez ayrıldı.
- Hücrelerin% 70-80 izdiham (genellikle normal insan fibroblastlar için iki gün, eğer kaplama 5x10 5 cells/100 mm levha) büyütün. Bu logaritmik büyüme hücreleri getirmek için en iyi transfeksiyon verimlilik için kritik önem taşımaktadır. M aşamasında aktif olarak büyüyen kültür hücreleri (yuvarlak hücreler yüzeye bağlı olarak görülen) içerir.
- TransfAmaxa Nucleofector aşağıdaki üreticinin tavsiyelerini kullanarak hücreleri vb. Fibroblastlar NHDF çözüm ve programı U20 kullanım içindir. Transfeksiyon için, iki adet 100 mm plakalar (~ 2x10 6 hücreleri) hücreler hasat . Bu hücrelerin aşırı trypsinize için kritik öneme sahiptir. Plakadan müstakil hücrelerinin% 80 olarak en kısa sürede trypsinization durdurun. NHDF çözüm hücrelerin yeniden süspanse edin. Hücreler NHDF çözüm duyarlıdır, bu nedenle, kuluçka süresi en aza indirmek ve hücreleri hafifçe karıştırın. Lineerleştirilmiş muhabiri inşa 0.5 mikrogram ile hücreleri Transfect. Normal insan fibroblastlar sonucu bir muhabir tek bir kopyasını entegrasyonu ile kullanılan bu transfeksiyon koşulları, integrants çoğunluğu oluştururlar.
- 1 mg / ml geneticin (G418) 24 saat sonra transfeksiyon ekleyerek kromozomal olarak entegre muhabiri yapıları hücreleri seçin. 7-10 gün için seçim devam edin.
- G418 dirençli koloniler (tek tek koloniler veya havuz dirençli klonlar seçebilirsiniz) seçin. Yaklaşık beş adet 100 mm plakalar kültür genişletin. Ileride kullanmak için üç tabak dondurma ve istenilen hücre sayısı (genellikle on adet 100 mm plakalar beş transfections için yeterli) kalan iki tabak genişletmek.
- Hücrelerin% 70-80 izdiham (100 mm fibroblastlar için plaka başına 5x10 5 hücre kaplama iki gün sonra) ulaştığında, hücreler I-SCEI plazmid ifade ile transfekte hazır.
3. I-SCEI Endonuclease geçici İfade DSB İndüksiyon
- Transfect Amaxa Nucleofector (fibroblastlar için NHDF çözüm ve U20 programı kullanarak bir transfeksiyon verimlilik kontrolü gibi ifade plazmid ve 0.1 mg pDsRed2-N1 (Clontech) 5 mg I-SCEI karışımı ile logaritmik olarak büyüyen kültür ~ 2x10 6 hücre (iki tabak) .)
- (Ii) 5 mg pDsRed2-N1; bir kontrol (iii) 5 mg plazmid bir ifade değildir bu, aynı zamanda 5 mg EGFP ifade plazmid (i) ~ 2x10 6 hücre trasfecting FACS üç kalibrasyon kontrolleri hazırlamak floresan protein (plazmid kodlama HPRT minigene kullanıyorum).
- GFP ve DsRed proteinleri ifade için yeterli zaman sağlamak için dört gün boyunca hücreler büyürler.
- Transfeksiyon sonra, inverted mikroskop, GFP ve DsRed tespiti için filtreler ile floresan transfeksiyon ve GFP ve DsRed proteinleri ifade etkinliğini doğrulamak (isteğe bağlı) Üç gün.
4. Akış Sitometri GFP + ve DsRed + Hücreler Analizi
- Dört gün transfeksiyon hasat I-SCEI transfekte hücreleri ve kontrol hücreleri. PBS 500 mcL hücrelerin yeniden süspanse ve FACS tüpleri hücreleri aktarmak. Bu aşamada tüm hücreleri hasat ve yuvarlak hücreler için çok önemlidir. Bunu başarmak için, bu, uzun bir trypsinization süre ya da daha güçlü bir tripsin kullanılması tavsiye edilir. Hücrelerin% 99 plaka kopuk olduğunu onaylayın ve yuvarlak hücrelerin mikroskop altında gözlemleyerek var. (Folyo ile buz kovasının kapağını), ışıktan koruyarak buz üzerinde hücreleri saklayınız. Bir kaç saat buz üzerinde hücreleri saklamak mümkündür. En iyi sonuçları hemen hasattan sonra hücrelerin analiz.
- GFP, DsRed ve negatif kontroller FACS Kalibre. Analizinde tüm floresan hücreleri (Şekil 4) dahil etmek için gerilim ve renk tazminat ayarlayın. Deneysel örneklerin floresan yoğunluğu daha kontrollerin düşük olacağını aklınızda bulundurun.
- Analiz I-SCEI FACS transfekte hücreler. Her tedavi için en az 20.000 hücreleri saymak. GFP ve DsRed floresan GFP yüzde + veya DsRed + hücrelerin% 25 altında tutulması tavsiye edilir. Arasındaki potansiyel bir girişimi önlemek için DsRed + veya GFP + hücrelerin yüzdesi yüksek ise pDsRed2-N1 veya I-SCEI plazmid miktarını azaltır. Deneylerde sadece plazmid pDsRed2-N1 miktarını ayarlamak için gerekli değil, I-SCEI plazmid.
- GFP + hücreler, DNA DSB onarım verimliliği yüzde karşılık gelir ve DsRed + hücrelerinin yüzde transfeksiyon etkinliğini gösterir. DsRed + hücreleri GFP + hücrelerin oranı göreli olarak DNA DSB onarım verimliliği hesaplayın.
- Tamir sonuna kavşak onarım doğruluğunu test etmek için sıralı olabilir. Muhabir yapıları, çoğaltma E.coli kökeni ve kanamisin direnç genleri (Şekil 1) içerir . Bu, genomik DNA EcoRI enzim, recircularization ve yetkili E.coli hücreleri dönüşüm ile sindirerek yapıları tahlisiye sağlar . Kurtarıldı plazmid sonra kısıtlama sindirim ve sıralama ile analiz edilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 4 ve 5 kontrol transfections ve NHEJ ve İK deneyleri Tipik FACS sonuçlar gösterilmiştir. Floresan yoğunluğu ve floresan hücrelerinin sayısı bütünleşik içeren I-SCEI transfekte hücreler daha düşük olacaktıred NHEJ ve İK yapıları (Şekil 5), GFP ve bu hücrelerin DsRed yapıları kopya sayısı farkı nedeniyle denetimleri (Şekil 4) karşılaştırıldı. Deneyde Her hücre entegre muhabiri yapının sadece bir kopyasını içerir, böylece başarılı onarım olaylar sulandırmak hücrelerin bir kısmı, GFP geninin. Insan fibroblastlar 0.1 mikrogram pDsRed2-N1 Transfeksiyon hücre başına yaklaşık 1 plazmid kopyasını sağlar.
NHEJ ve İK etkinliğinin GFP + / DsRed + hücreleri bir oranı olarak hesaplanır. NHEJ 2 insan hücrelerinde İK daha verimli bir süreçtir. Insan fibroblastlarında NHEJ verimliliği genellikle 0,6-1,3, ve İK verimliliği 0.05-0.3. DSB verimliliği bir oranı GFP olarak ölçülür + / DsRed + I-SCEI ve DsRed2-N1 plazmid karışım hücreleri varyasyonlar sonucu etkileyebilir. Plazmid kalitesi de transfeksiyon verimliliği değiştirerek sonuçlarını etkileyebilir. Bu nedenle, tutarlı ölçümler elde etmek, bir deneyde içinde aynı plazmid karışımı kullanmak önemlidir. Ayrıca, DSB onarım verimliliği, hücre tipi, hücre döngüsü faz ve entegre yapıları kromozomal konumu etkilenir.
Şekil 1. Muhabir NHEJ (A) ve İnsan Kaynakları (B), DNA DSB onarım analizi için oluşturur . (C) Uyumsuz DNA iki ters I-SCEI siteleri sindirim tarafından oluşturulan biter SD, ek donör; SA, ek alıcısı, gölgeli meydanları, polyadenylation siteler; iki yararlanıcı tarafından kontrol Neo / Kana, tek ORF: SV40 görüşmekte neomisin direnç memeli hücreleri; ve E. coli β-laktamaz görüşmekte kanamicyn direnci; Ori, E. Coli puc çoğaltma kökenlidir.
Şekil 2. . Muhabir NHEJ analizi için inşa GFP geninin etkin yapı, ancak bir DSB ve başarılı NHEJ indüksiyonu üzerine inşa GFP + olur. Aşağıda gösterildiği NHEJ bu muhabir bir onarım ürün.
Şekil 3. Muhabir, gen dönüşümü ile HR analizi için inşa gen dönüşüm (GC) I-SCEI, İK DSBs indüksiyonu sırasında aktif bir GFP genini yeniden . GC, crossing-over (X-over), tek iplikçik tavlama (SSA) ve NHEJ: Aşağıda gösterilen, büyük DNA onarım yolları bu muhabir tamir ürünlerdir. X-over onarım ürün intramoleküler rekombinasyon için gösterilir, exramolecular rekombinasyon aynı ürün, ama bir kromozom üzerinde yer alan olacaktır. Ifade aktif GFP protein genleri (GFP +) yeşil renk ile gösterilir.
Şekil 4. FACS analizi için parametreleri Kalibrasyon (A) Fibroblastlar oto floresan hücreleri hariç olmak için bir negatif kontrol olarak kullanılan plazmid pHPRT transfekte. (B) Fibroblastlar GFP + hücreler (yeşil alan) için yolluk ayarı için kullanılan, plazmid pEGFP ile transfekte. (C) Fibroblastlar DsRed + hücreleri (kırmızı bölge) için yolluk ayarı için kullanılan plazmid pDsRed2-N1, transfekte.
Şekil 5. Tipik kromozomal olarak entegre muhabiri yapıları ile normal insan fibroblastlarında NHEJ (A) ve İnsan Kaynakları (B) analiz sonuçları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Floresan NHEJ ve İK muhabiri deneyleri, in vivo olarak ayrı ayrı her bir DSB onarım yolu ölçmek için nicel bir yol sağlar. Deneyleri, FACS güvenilir 20.000 hücre 10 GFP + hücreleri tespit edebilen çok duyarlıdır. Testler GFP + hücreler görünümünü DSBs 2 indüksiyon sonrası dakika veya saat içinde tespit ederek "gerçek zamanlı" onarım olaylarını ölçmek için adapte olabilir. Ayrıca, GFP + hücrelerin analizi DSB onarım sonra farklı hücre döngüsü aşamasında analiz edilmesi gereken çeşitli ilaçlar ile tedavi olduğunu tutuklama hücre bölünmesi 6 sağlayan ek hücre proliferasyonu güvenmeye gelmez. Bu, seçilebilir bir marker sulandırıldıktan muhabir yapıları üzerinde önemli bir avantaj sağlar.
NHEJ süreci özünde biter kavşaklarda hata eğilimli üreten çeşitli küçük düzenlenmeleri. Bizim NHEJ muhabiri eşsiz bir özelliğe sahiptir. Onarım olaylar böylece NHEJ olayların geniş bir yelpazede tespit sağlayarak, silme ve eklemeler tahammül bir intron içinde ortaya. NHEJ NHEJ ve İK karşılaştırmalı analizini sağlayan bir yapı olarak İK inşa aynı değiştirilmiş, GFP geninin dayanmaktadır. Floresan NHEJ ve İK testlerin kullanımı memeli DSB onarım çalışmaları kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Orijinal GFP-Pem1 Dr Lei Li bir hediye oldu. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve Ellison Tıp Vakfı VG hibe tarafından desteklenen ve AS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| pDsRed2-N1 | Clontech Laboratories | 632406 | |
| Round bottom tubes | BD Biosciences | 352058 | FACS tubes |
References
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
