Insect Puparium verwijdering: een methode voor poponderzoek

Overview

Dit artikel beschrijft een techniek om het puparium van een insect te verwijderen terwijl de binnenpop intact blijft en daarom geschikt is voor verder onderzoek. Het voorbeeldprotocol toont de procedure met Drosophila guttifera; deze techniek is echter van toepassing op andere Drosophila-soorten.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Fukutomi et al., Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera, J. Vis. Exp. (2018).

1. Puparium verwijderen

OPMERKING Poppen van Drosophila worden gedekt door een structuur die het puparium wordt genoemd. Een insect van Muscomorpha (vliegen) werpt zijn larve cuticula niet af bij verpopping; in plaats daarvan verhardt het de nagelriem na apolyse en gebruikt het als een beschermende hoes van de pop, het puparium. Een pop die in een puparium verblijft, heeft een echte pop cuticula, die erg zacht en fragiel is. Voordat apolyse rond P4(ii) plaatsvindt, worden epithelia en puparium aan elkaar bevestigd, waardoor het verwijderen van het puparium zonder schade erg moeilijk is. Na P5 is het verwijderen van het puparium arbeidsintensief, maar nuttig voor morfologische observatie en definitie van popstadia. Het proces wordt als volgt uitgevoerd.

1. Plak een stuk dubbelzijdige tape op een stuk keukenpapier.
2. Plaats een pop op de dubbelzijdige tape ventrale kant naar boven (Figuur 1A).
3. Zoek de ruimte tussen de voorste kant van het puparium en de interne pop. Pak het puparium rond deze opening vast en verwijder het met behulp van een tang en stel de voorste kant van het hoofd van de pop bloot.
4. Plaats de punt van een tang door deze parallel aan de voorste-posterieure as te verplaatsen. Til de punt van de tang op om het puparium lokaal te breken. Herhaal deze actie totdat de breuk het achterste deel van het puparium bereikt. Zorg ervoor dat er ook een opening ontstaat tussen het puparium en de poppoten, en breek de ventrale kant van het puparium en minimaliseer de schade aan de interne pop (figuur 1B).
5. Haal na het breken van het puparium zoveel mogelijk de pop eruit met een fijne kwast (#5/0) (figuur 1C).
6. Plaats de pop op een stuk tissuepapier dat is bevochtigd met ddH₂O en in een plastic petrischaaltje (diameter 60 mm x hoogte 15 mm) is geplaatst. Maak zo snel mogelijk foto's omdat de blootgestelde pop kwetsbaar is en gemakkelijk droog wordt.
    

Representative Results

Figuur 1. Illustratie van het verwijderen van puparium. (A) Plaats een pop ventrale kant naar boven op een stuk dubbelzijdige tape. Verwijder het voorste deel van het puparium. (B) Breek het puparium met een tang van de ventrale kant. (C) Haal na het breken van het puparium de pop eruit met een penseel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila guttifera	The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera,  a fruit fly species used in this article
NICETACK double sided tape	Nichiban	NW-15SF	Double sided tape,   for removing puparium
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Forceps,  for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush	Talens Japan	GWVR-#5/0	Paint brush,  for removing puparium
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	Stereomicroscope,  for morphological observation
Digital camera	Olympus	DSE-330-A	Digital camera,  for imaging
Falcon standard tissue culture dish	Corning	353002	Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)