הסרת פופאריום חרקים: שיטה לחקירת פופל

Overview

מאמר זה מתאר טכניקה להסרת puparium של חרק תוך שמירה על גולם פנים שלם ולכן מתאים לחקירה נוספת. פרוטוקול הדוגמה מציג את ההליך עם דרוזופילה גוטיפרה; עם זאת, טכניקה זו חלה על מינים אחרים של דרוזופילה.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Fukutomi ואח ', שיטות לביים תקופות פופל ומדידה של פיגמנטציה כנף של דרוסופילה גוטיפרה, J. Vis. Exp. (2018).

1. הסרת פופאריום

שים לב גולם של דרוסופילה מכוסה על ידי מבנה שנקרא puparium. חרק של מוסקומורפה (זבובים) אינו משיל את קוטיקל הזחל שלו בגור; במקום זאת, הוא מקשיח את הקוטיקל לאחר האפוליזה, ומשתמש בו ככיסוי מגן של הגלם, puparium. גולם המתגורר בתוך puparium יש קוטיקל pupal אמיתי, שהוא רך מאוד שביר. לפני apolysis מתרחש סביב P4(ii), אפיתליה ו puparium מחוברים יחד, ולכן הסרת puparium ללא נזק קשה מאוד. לאחר P5, הסרת puparium הוא מייגע, אבל שימושי עבור התבוננות מורפולוגית והגדרה של שלבי pupal. התהליך מתבצע כדלקמן.

1. הדבק חתיכת סרט הדבקה דו-צדדי על פיסת מגבת נייר.
2. הניחו גולם על צד הגחון הדו-צדדי של הקלטת כלפי מעלה (איור 1A).
3. אתר את החלל בין הצד הצדדי של puparium ואת הגומה הפנימית. לתפוס ולהסיר את puparium סביב הפער הזה באמצעות מלקחיים, ולחשוף את הצד הצדדי של הראש של הגור.
4. הכנס את קצה המלקחיים על-ידי הזזתו במקביל לציר האחורי-שני. הרם את קצה המלקחיים כדי לשבור את הפופאריום באופן מקומי. חזור על פעולה זו עד שבירה מגיע לחלק האחורי של puparium. ודאו שנוצר גם פער בין הרגליים puparium ו pupal, ולשבור את הצד הגחוני של puparium ולמזער את הנזק לגולם הפנימי (איור 1B).
5. לאחר שבירת הפופאריום ככל האפשר, מוציאים את הגומי באמצעות מברשת צבע עדינה (#5/0)(איור 1C).
6. מניחים את הגולם על פיסת נייר טישו כי כבר לח עם ddH₂O והניח בצלחת פטרי פלסטיק (קוטר 60 מ"מ x גובה 15 מ"מ). צלם בהקדם האפשרי כי גלם חשוף פגיע בקלות הופך יבש.
    

Representative Results

איור 1. איור של הסרת פופאריום. (א) מניחים צד גחוני של גולם על פיסת סרט דו-צדדי. הסר את החלק קדמי של puparium. (B) לשבור את puparium עם מלקחיים מהצד הגחוני. (ג) לאחר שבירת puparium, להוציא את הגומי באמצעות מברשת צבע.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila guttifera	The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera,  a fruit fly species used in this article
NICETACK double sided tape	Nichiban	NW-15SF	Double sided tape,   for removing puparium
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Forceps,  for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush	Talens Japan	GWVR-#5/0	Paint brush,  for removing puparium
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	Stereomicroscope,  for morphological observation
Digital camera	Olympus	DSE-330-A	Digital camera,  for imaging
Falcon standard tissue culture dish	Corning	353002	Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)