Rimozione del puparium di insetti: un metodo per l'indagine sulle pupe

Overview

Questo articolo descrive una tecnica per rimuovere il puparium di un insetto mantenendo intatta la pupa interna e quindi adatta per ulteriori indagini. Il protocollo di esempio mostra la procedura con Drosophila guttifera; tuttavia, questa tecnica è applicabile ad altre specie di Drosophila.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Fukutomi et al., Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera, J. Vis. Exp. (2018).

1. Rimozione del puparium

NOTA Le pupe di Drosophila sono coperte da una struttura chiamata puparium. Un insetto di Muscomorpha (mosche) non perde la sua cuticola larvale alla pupa; invece, indurisce la cuticola dopo l'apolisi e la usa come copertura protettiva della pupa, il puparium. Una pupa residente all'interno di un puparium ha una vera cuticola pupa, che è molto morbida e fragile. Prima che l'apolisi abbia luogo intorno a P4(ii), epitelia e puparium sono attaccati insieme, e quindi rimuovere il pupario senza danni è molto difficile. Dopo P5, rimuovere il puparium è laborioso, ma utile per l'osservazione morfologica e la definizione degli stadi pupali. Il processo viene eseguito come segue.

1. Apporre un pezzo di nastro a doppia parte su un pezzo di carta assorbente.
2. Posizionare una pupa sul lato ventrale a nastro a doppia parte verso l'alto (Figura 1A).
3. Individuare lo spazio tra il lato anteriore del puparium e la pupa interna. Afferrare e rimuovere il puparium intorno a questo spazio usando le forcep ed esporre il lato anteriore della testa della pupa.
4. Inserire la punta di una forza spostandola parallelamente all'asse anteriore-posteriore. Sollevare la punta delle forcep per rompere localmente il puparium. Ripetere questa azione fino a quando la rottura raggiunge la parte posteriore del puparium. Assicurarsi che si formi anche uno spazio tra il puparium e le gambe pupali e rompere il lato ventrale del puparium e ridurre al minimo il danno alla pupa interna (Figura 1B).
5. Dopo aver rotto il puparium il più possibile, eserti la pupa usando un pennello fine (#5/0) (Figura 1C).
6. Posizionare la pupa su un pezzo di carta velina che è stato inumidito con ddH₂O e posto in una piastra di Petri di plastica (diametro 60 mm x altezza 15 mm). Scatta fotografie il prima possibile perché la pupa esposta è vulnerabile e diventa facilmente asciutta.
    

Representative Results

Figura 1. Illustrazione della rimozione del puparium. (A) Posizionare un lato ventrale della pupa su un pezzo di nastro a doppia aspetto. Rimuovere la parte anteriore del puparium. (B) Rompere il puparium con le flesse dal lato ventrale. (C) Dopo aver rotto il puparium, eserti la pupa usando un pennello.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila guttifera	The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera,  a fruit fly species used in this article
NICETACK double sided tape	Nichiban	NW-15SF	Double sided tape,   for removing puparium
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Forceps,  for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush	Talens Japan	GWVR-#5/0	Paint brush,  for removing puparium
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	Stereomicroscope,  for morphological observation
Digital camera	Olympus	DSE-330-A	Digital camera,  for imaging
Falcon standard tissue culture dish	Corning	353002	Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)