乳腺脂肪パッドへの異交性注入:マウスにおける乳癌の確立

Overview

この記事では乳がん細胞を乳腺脂肪パッドに注入して、雌マウスの乳がんモデルを確立する方法を論じ合う。このプロトコル例は、正交性注入を示しています。

Protocol

動物実験は中国実験動物管理法の規定と一般勧告に従って実施され、資本医科大学動物医療利用機関によって承認された(参考文献AEEI-2014-052)。6〜8週齢の雌のBalb/cマウスを使用した。

1. 細胞・動物の調製

1. 手術の1日前に、4番目の乳首の周りに髪を剃り、手術領域を露出させます。
   1. 片手でマウスを後ろにしっかりと握り、マウスが自由に動かないことを確認し、マウスを上げて腹をオペレータにさらし、別の手で4番目の乳首の周りの毛皮を電子剃毛で剃ります。
   2. 乳首の周りに薄い脱毛クリームの層を30〜60s入れ、蒸留水でクリームをきれいにし、柔らかい紙でマウスを乾燥させます。
2. 手術当日、マウス乳癌細胞(4T1-luc2)を採取し、細胞数を数え、無菌マイクロ遠心チューブ中のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞密度を2 x 10⁵細胞/mLに調整し、氷の上に保管します。マウスごとに、1 mLシリンジに1 x 10⁴細胞/50μLを用意します。

2. 正交性注入

1. マウスの麻酔
   1. 麻酔を誘発する。閉じた透明な容器にマウスを入れ、2%のイソフルランガスをオンにしてマウスを約5分間麻酔し、すべてが横になって眠りに落ちるまで。
   2. 麻酔を維持する。マウスを容器から個々の麻酔マスクに移し、乾燥を避けるために目に獣医の軟膏を入れ、乳首をオペレーターにさらしてマウスをぴくぴらに保ち、注射が行われるまで数分間イソフルランガスを吸い込み続けます。
   3. つま先ピンチ離脱反射の欠如により麻酔の成功を確認する。
   4. 眼の乾燥を防ぐためにマウスの目に眼科軟膏を適用します。
      注 容器の大きさと利用可能な個々の麻酔マスクの数に応じて、マウスのグループを一緒に麻酔し、個々の麻酔下で1つずつ注射することができる。
2. 注射の性能
   1. 片手でピンセットで4番目の乳首の周りの皮膚をテントアップし、シリンジが続く高揚した「トンネル」を設置します。もう一方の手を使用して、針を上向きにして注射器を保持し、乳首から5〜10mmで皮下に入ります。次に、針の先端が乳首に近づくまで「トンネル」に従い、針の目が乳首の先端の下に来るまで針の先端を乳首脂肪パッドに慎重に上げ、ピンセットを捨て、細胞をゆっくりと注入します。
   2. 針を少し回して、ゆっくりと注射器を引っ込め、綿棒を使用して針の傷を10~20sの針を押して、液体の浸透がないことを確認します。
   3. 4番目のニップルを観察して、注入に成功したことを確認します:中心として乳首を持つ白い透明な平らな球が1つ観察される(図1)。
3. マウスが回復し、あまりにも速く動くことを避けるために、マウスを麻酔し続けると、注射創傷が開き、腫瘍細胞が漏れ出す原因となります。

図1:雌のBalb/cマウスの乳腺脂肪パッドでの正交性注入の前後の写真。手術を行い、マウスがイオブルラン麻酔下にある間に写真を撮影した。A,注射前、B、注射後.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anesthesia machine	Midmark Corporation, Dayton, OH, USA	Matrx VMS	anesthesia
isoflurane	Hebei yipin chemical reagents  company	O21400	anesthesia
1 mL syringe	Becton, Dickinson and  Company	A257	cell injection
hair removal cream	Veet	-	hair removal cream
Carbomer Eye Gel	Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH	-	ophthalmic ointment