Summary
We beschrijven een methode om aparte organellen door de dichtheid in het leven
Abstract
Een belangrijke strategie voor het zuiveren en het isoleren van verschillende types van intracellulaire organellen is om ze van elkaar te scheiden op basis van verschillen in de opwaartse dichtheid. Echter, wanneer de cellen worden verstoord voorafgaand aan centrifugeren, eiwitten en organellen in deze non-native omgeving vaak ten onrechte aan elkaar plakken. Hier beschrijven we een methode om aparte organellen door de dichtheid in intacte, levende Drosophila embryo's. Vroege embryo's voordat cellularization worden geoogst van de bevolking kooien, en hun uiterlijke eierschalen worden verwijderd door behandeling met 50% bleekmiddel. Embryo's worden vervolgens overgebracht naar een kleine agar plaat en geplaatst, posterior eind eerste, in kleine verticale gaten in de agar. De platen met ingesloten embryo's worden gecentrifugeerd gedurende 30 minuten bij 3000g. De agar ondersteunt de embryo's en houdt ze in een bepaalde oriëntatie. Daarna worden de embryo's gegraven uit de agar met een stompe naald.
Centrifugeren scheidt grote organellen in verschillende lagen, een stratificatie goed zichtbaar door de heldere-veld microscopie. Een aantal van fluorescente markers zijn beschikbaar voor een succesvolle stratificatie te bevestigen in levende embryo's. Eiwitten in verband met bepaalde organellen zal worden verrijkt met een bijzonder laag, waaruit blijkt colocalization. Afzonderlijke lagen kunnen worden teruggewonnen voor biochemische analyse of transplantatie in donoreicellen. Deze techniek is van toepassing op organel scheiding in andere grote cellen, inclusief de eieren en eicellen van diverse soorten.
Protocol
1) voorbereiden agarplaten
Overzicht: Dit protocol maakt gebruik van agar platen voor twee verschillende toepassingen. Ten eerste, de agar platen dienen als ei-collectie oppervlak; appelsap in de agar stimuleert ei leggen. Ten tweede worden embryo's ingebed in de agar gehouden in een vaste oriëntatie als de platen worden gecentrifugeerd, een voldoende hoge concentratie van agar is nodig om de platen te voorkomen dat desintegratie tijdens het centrifugeren. Omwille van de eenvoud, is een enkel type van appelsap agar gebruikt voor beide toepassingen.
Materialen
- Agar (25 g)
- Sacharose (25 g)
- Appelsap (250 ml)
- Nipagin M stamoplossing (5 g Methyl-p-hydroxy-benzoaat in 50 ml ethanol), werkt als conserveermiddel
- Petrischalen: voor centrifugeren (60x15mm) en voor ei-collectie (60x15 mm of 100x15 mm, afhankelijk van de fly kooien gebruikt in stap 2)
Uitrusting
- Kookplaat
- Twee erlenmeyers
- In een erlenmeyer, combineer 25 g agar en 750 ml dH 2 O. Autoclaaf gedurende 50 min op vloeistof cyclus. In de tussentijd, voor te bereiden appelsap oplossing (stap 1.2).
- In een andere erlenmeyer combineren 25 g sucrose en 250 ml appelsap. Warmte op hete plaat (tot ongeveer 55 ° C) om sucrose te ontbinden. Voeg vervolgens 15 ml Nipagin M oplossing. Vermijd hogere temperaturen, aangezien dit kan leiden tot Nipagin te breken.
- Zodra de agar oplossing heeft genoeg afgekoeld dat de kolf kunnen worden afgehandeld met de hand, combineren de twee oplossingen en meng goed. Roer op hete plaat tot het gelijkmatig gemengd is.
- Giet oplossing in petrischalen (~ 0,5 cm hoog). 1 liter van de oplossing is voldoende voor ongeveer 100 kleine (60 mm diameter) of 40 grote (100 mm diameter) gerechten.
- Agarplaten moet droog gedurende enkele uren of overnacht bij kamertemperatuur, anders worden ze te nat voor gebruik. Voor de lange-termijn opslag, houd ze verpakt (in plastic bakken of een petrischaal mouwen) bij 4 ° C.
2) Oogsten embryo's
Overzicht: Tijdens de eerste drie uur van de ontwikkeling (op kamertemperatuur), Drosophila embryo's worden enkele cellen (niet meegerekend de kiem-lijn voorlopers, de achterzijde bevindt paal cellen). Op de juiste wijze georiënteerd embryo's van deze fasen worden gecentrifugeerd, de belangrijkste organellen gescheiden door de dichtheid langs de lange as van het ei. Op de cellularization stadium is deze grote cel omgezet in duizenden kleine cellen, de gebruikte centrifugeren krachten zullen niet breken deze cellen. Voor een succesvolle scheiding van de belangrijkste organellen, is het daarom van cruciaal belang voor embryo's die nog niet hebben voltooid cellularization centrifuge.
Materialen
- Appelsap agarplaten
- Gist pasta (droge gist gemengd met water om pindakaas consistentie)
Uitrusting
- Fly kooien: commercieel beschikbaar (zie hieronder) of home-made een
- Volwassen vliegen worden gehouden in kooien waarin appelsap agar-platen zijn bevestigd aan de onderkant. Gebruik een grootte van petrischalen geschikt is voor de kooien in gebruik is.
- Te starten een ei collectie, bereiden een vers appelsap agar plaat en bedek een gedeelte met gist pasta. Fruitvliegen eten gist, in het bijzonder, gist levert voeding voor de productie van eieren. De aanwezigheid van gist en appelsap in de agar induceert ook eieren leggen.
- De uitwisseling van het oude met het nieuwe agar plaat, is de vlieg kooi omgekeerde en sloeg op de bank boven een paar keer. De vliegen zal vallen naar de bodem en zijn kort gedesoriënteerd. Dat geeft je een paar seconden om snel te verwijderen een agar plaat en te vervangen door een nieuwe. Deze uitwisseling duurt enige oefening, en de details zijn afhankelijk van het type kooi gebruikt.
- Vrouwtjes slaan het sperma van de vorige paringen in interne zakken (spermathecae), waarvan sperma wordt vrijgegeven aan bevruchting van eieren toe te staan. Als het goed gevoed en ongestoord, vrouwtjes leggen eieren kort na de bevruchting, en dus de tijd van de eileg markeert het moment van bevruchting en het begin van ontwikkeling. Als de omstandigheden niet optimaal zijn, vrouwtjes houden bevruchte eieren voor variabele tijden voor het leggen. Om het aantal van dergelijke mis-geënsceneerd embryo's, is het raadzaam zich te ontdoen van de eerste collectie van de werkdag (een "pre-collectie 'van 30 tot 60 minuten is voldoende). De aanwezigheid van de verse gist induceert de vrouwtjes te leggen deze gehouden eieren, en de daaropvolgende ei collecties meestal gedomineerd door de eitjes afgezet kort na de bevruchting.
- Verzamel eieren voor maximaal 3 uur, afhankelijk van het embryonale stadium gewenst is. Omdat bij kamertemperatuur cellularization is voltooid na ~ 3,5 uur, langer verzameling tijden zijn niet zinvol. Meest consistente gelaagdheid wordt bereikt in jonge embryo's, dus voor routine-experimenten voor kortere verzameling keer (1 uurof minder).
- Soms vliegt vast komen te zitten aan de gist of aan het oppervlak van de agar plaat. Verwijder ze met een pincet.
3) Het verwijderen van de eierschaal van de embryo's
Overzicht: Drosophila embryo's worden gedekt door twee beschermende lagen: een buitenste laag (chorion), gemaakt van eiwit en een binnenste laag (vitelline membraan) voornamelijk gemaakt uit was. Ze beschermen het embryo tegen mechanische beledigingen en uitdroging. Het chorion heeft twee uitbreidingen (de eicel filamenten of dorsale aanhangsels) die goed zichtbaar zijn als afzonderlijke structuren. In deze stap zullen we het chorion verwijderen door het weken de eieren in 50% bleekwater. Zodra het chorion is verwijderd, het embryo wordt transparant in doorvallend licht, waardoor selectie van specifieke embryonale stadia voor centrifugeren. Als het chorion zou ook interfereren met veel post-centrifugatie procedures (bijvoorbeeld fixatie in stap 6), verwijdering van de chorion nu snelle verwerking later toe te staan.
De 50% bleekmiddel behandeling lost het chorion binnen een paar minuten, maar het is niet schadelijk voor de embryo. De vitelline membraan houdt het bleekmiddel uit. We zullen doorgaan met de bleekmiddel behandeling tot het ei filamenten zijn niet meer zichtbaar zijn. Daarna zullen we scheiden de embryo's uit het bleekmiddel door het gieten van het embryo / bleekmiddel drijfmest door middel van een kleine zeef (een mand gemaakt van gaas). Het is van cruciaal belang niet te haasten het bleekmiddel blootstelling stap. Als het bleekmiddel wordt afgewassen voortijdig, later stappen (bijvoorbeeld door het wegvallen van de vitelline membraan volgende fixatie) kan worden aangetast.
Materialen:
- Squirt fles met 50% bleekwater (een volume dH 2 O tot een volume commerciële bleekwater)
- Squirt fles met dH 2 O
- Papieren handdoek
Uitrusting:
- Zelfgemaakte manden vervaardigd uit platen van roestvrij staal gaas. Te maken manden, knip vierkanten van ~ 2 x 2 cm uit de vlakke plaat en streepje ze in het midden.
- Pincet om draadmanden houden
- Dissectiemicroscoop opgezet voor transilluminatie
- Plaats de agar plaat onder een dissectiemicroscoop en observeer de embryo's door transilluminatie. Zorg ervoor dat het ei filamenten te identificeren (zie Figuur 2A).
- Squirt 50% bleekmiddel op de agar plaat, die de embryo's. Af en toe roeren de agarplaat te wervelen de embryo's rond in het bleekmiddel.
- Zodra het ei filamenten zijn niet meer zichtbaar (meestal na 3-5 min, maar de tijden kunnen variëren), is het chorion met succes verwijderd.
- In de volgende stap wordt een gaas mand te gebruiken als zeef om de embryo's te scheiden van het bleekmiddel. Pak de draad mand met een pincet en houd het over de omgekeerde deksel van de agarplaat. De cover zal dienen als reservoir voor het bleekmiddel druppelen via het gaas te vangen.
- Giet het bleekmiddel / embryo drijfmest uit de agarplaat door het gaas.
- Als een significant aantal van de embryo's blijven op de agarplaat, squirt dH 2 O op het bord en giet de dH 2 O / embryo drijfmest door de gaas. Als een significant aantal embryo's over te lopen in het reservoir, giet de inhoud reservoir door de gaas.
- Raak de onderkant van het gaas op een papieren handdoek te wissen weg overtollige vloeistof. Dan spuiten dH 2 O op het gaas te spoelen de overgebleven bleekmiddel. Zoals hierboven beschreven, kan de afdekplaat worden gebruikt als reservoir aan een embryo's per ongeluk afgewassen terug te krijgen. U kunt minimaliseren verliest embryo's door te wijzen de stroom van water uit de fles spuit langs de omtrek van de draad mand. Veel blot overtollige vloeistof.
- Herhaal deze wasstap vijf tot tien keer, totdat alle bleekwater is verwijderd. Als de draad mand nog steeds geur van bleekwater, moet wassen blijven.
4) Montage embryo's in agar
Overzicht: Drosophila eieren zijn veel langer (~ 500 micrometer) dan breed (~ 180 pm). Om maximale en constante scheiding van organellen te krijgen tijdens het centrifugeren, we oriënteren embryo's dat hun voorste uiteinden wijzen naar het middelpunt van de rotatie (figuur 1, 3). Op die manier, de lichtste intracellulaire structuren (lipide druppels) zich ophopen aan de voorste einde in alle embryo's, terwijl de zeer dichte structuur (dooier componenten) zich ophopen in de buurt van het achterste einde. Embryo's worden ingebracht in kleine verticale gaten in appelsap agar, met de voorste uiteinden omhoog steken. De agar houdt de embryo in een vaste oriëntatie tijdens het centrifugeren.
Uitrusting:
- Naaldhouder
- Wolfraam naalden, de naalden zijn gemonteerd in de houder naar achteren van de typische oriëntatie, zodat het stompe uiteinde steekt en is beschikbaar voor de embryo's te manipuleren
- P200 pipet
- Dissectiemicroscoop opgezet voor transillumination
- Fly borstel (kleine kwast gebruikt om de volwassen Drosophila sorteren)
Materialen:
- Triton Salt Solution (TSS): 4g NaCl, 0,3 ml Triton X-100, te vullen met DDH 2 O tot 1000 ml (kan worden gemaakt als een 10x voorraad-oplossing)
- Was de embryo's uit de draad mand met TSS en in een lege petrischaal. De embryo's moeten zinken naar de bodem. Breng de petrischaal met de embryo's in TSS op een dissectie omvang en observeren door transilluminatie (embryo's ziet er vergelijkbaar met die afgebeeld in figuur 4).
- Met behulp van een pipet P200, kiest u de gewenste embryo's van podia en overbrengen naar een kleine agarplaat. Specifieke fasen kan eenvoudig visueel worden herkend (figuur 4, voor meer informatie, zie 1). Werk snel, omdat embryo's zijn de vergrijzing en langdurige onderdompeling (langer dan 30 min) in TSS van invloed kunnen zijn ontwikkeling.
- Verwijder de meeste TSS met een pipet en een Kimwipe. Het oppervlak van de agar moet iets vochtig, waardoor het gemakkelijker om duwen embryo's. Er moet echter niet worden poelen van vloeibaar blijven overal op de plaat, omdat overtollige vloeistof tijdens het centrifugeren zorgt ervoor dat de embryo's uit schuiven van de gaten.
- Met behulp van een naald, prik verticale gaten in de agar in de buurt, waar een embryo zich bevindt. Het is moeilijk om gaten die perfect verticale zak, want je moet de naald te houden onder een hoek te kunnen gelijktijdig kijken onder de microscoop. Een kleine helling van de naald is eigenlijk voordelig, omdat dit zorgt voor een lichte depressie / bos aan de ene kant van het gat, zodat het embryo zal gemakkelijk glijden langs het en in het gat. Het is voldoende om het doorprikken van de oppervlakte van de agar agar, omdat het is zacht genoeg dat ooit een embryo gedeeltelijk wordt ingebracht in een gat kan worden geduwd verder zonder schade.
- Zorg ervoor dat u herkent de voorste en achterste uiteinden van de embryo's, als de embryo's moet worden geduwd in de gaten van een vaste koers uit, meestal met het voorste belanden. De vitelline membraan aan het voorste einde wordt gekenmerkt door een gespecialiseerde structuur, de micropyle (Figuur 2), waardoor het sperma komt tijdens de bevruchting.
- Met behulp van de stompe uiteinde van de naald, kunt u op tegen het embryo om het te verplaatsen langs de agar en te oriënteren / haar achterste einde te manoeuvreren naar een lek gat. Duw tegen het voorste einde naar het gat. Dit moet het embryo gemakkelijk glijden in het gat langs de lichte depressie die tijdens doorprikken. Als het embryo kantelt omhoog, duw hem dieper naar beneden in het gat.
- Wanneer ze volledig ingedrukt, het embryo is meestal al redelijk verticaal. Zo niet, dan kan het uitlijnen van de geplaatste embryo meer verticaal door te drukken op het zijdelingse. Als het gat niet te groot is, zal het embryo positie stabiel gehouden worden door de agar heel centrifugeren.
- Met de praktijk, is het mogelijk om te sluiten 100-250 embryo's per plaat. Het zal afhangen van de specifieke toepassing hoeveel er nodig zijn: Als embryo's worden gebruikt voor live beeldvorming of als donor voor de transplantatie-experimenten, maar weinig nodig. Als embryo's worden vastgesteld en immunostained, zal een fractie verloren gaan tijdens de post-centrifugatie verwerken, en men moet beginnen met hogere cijfers. Houd in gedachten dat embryo's zich verder ontwikkelen tijdens de montage dus als een smalle ontwikkelingsfase is gewenst, de totale tijd voor het monteren moet worden kort gehouden.
- Als er embryo's overgebleven die niet werden ingesloten, verwijder ze uit de plaat met een vochtig vlieg borstel. Dip-the-fly penseel in vloeistof (bijvoorbeeld 1xTSS), zorgvuldig veeg over de bovenkant van de plaat (terwijl u onder het ontleden scope) te vegen overgebleven embryo's, en was de embryo's uit de borstel door dompelen de kwast in de vloeistof weer.
5) Centrifugeren en herstel van embryo's
Overzicht: De platen zijn overgebracht naar swingende emmers van een Sorvall RT7 Plus centrifuge en gecentrifugeerd gedurende 30 minuten bij 4000 rpm, wat overeenkomt met ~ 3000 g. Na het centrifugeren, worden de platen bedekt met TSS. Met een naald, worden embryo's uitgegraven van de gaten in de agar en overgebracht in een geschikte schepen via een pipet.
Uitrusting:
- Naaldhouder met naald (zoals voordien)
- Sorvall RT7 Plus met RTH750 rotor en swingende emmers, of gelijkwaardig 2
- Dissectiemicroscoop opgezet voor transilluminatie
- P200 pipet
Materialen:
- TSS
- Overdracht platen op swingende emmers van de centrifuge, agar naar beneden. Zorg ervoor dat centrifuge is evenwichtig.
- Instellingen voor centrifugeren: temperatuur = 4-10 ° C, rpm = 4000, tijd = 30 minuten.
- Na het centrifugeren, plaats agar plaat onder de dissectiemicroscoop opnieuw en bedek de plaat met een laag van TSS.
- Met behulp van de bLunt uiteinde van de naald, graven de embryo's uit hun holen. Zij zullen drijven in TSS, maar blijft onder water.
- Embryo's zal verschijnen uiteraard gelaagd, met een bruine pet aan het voorste einde, een duidelijke middengebied, en een donkere, grijze gebied aan het achterste einde (figuur 2, 5A). Gooi embryo's die niet aan duidelijke gelaagdheid te tonen.
- Met behulp van een pipet P200, de goed gelaagde embryo's in TSS om een nieuw schip overdracht, bijvoorbeeld een scintillatieflesje of microcentrifugebuis, afhankelijk van de toepassing.
6) Verdere verwerking
Afhankelijk van de toepassing, zal embryo's vervolgens worden behandeld op verschillende manieren.
- Voor directe observatie door bright-field of epifluorescentie microscopie, worden embryo's in de buffer op een glasplaatje, en gemonteerd onder een 22x22 mm # 1,5 dekglaasje, met 18x18 mm # 1 dekglaasjes als afstandhouders. Voor langdurige observaties, kan het nodig zijn om de buffer te vervangen door halogene olie 27.
- Als embryo's moeten worden vastgesteld, moeten ze worden overgebracht in stap 5.6 op een scintillatieflesje. Ze kunnen dan worden vastgesteld met behulp van standaard technieken een fixatie. Deze technieken gebruiken meestal agitatie in een heptaan-methanol emulsie om de vitelline membraan te verwijderen. Merk op dat voor gecentrifugeerd embryo's de efficiëntie van deze devitellinization stap laag is. Het is daarom raadzaam om te beginnen met zoveel mogelijk embryo's als praktisch of om de vitelline membraan te verwijderen handmatig 1.
- Als embryo's zal worden gebruikt in transplantatie-experimenten (bijv. om een bepaald organel laag te verwijderen uit de gecentrifugeerd embryo's), worden ze overgebracht naar agar platen en gemonteerd op dekglaasjes, met behulp van standaard-procedures als voor uncentrifuged embryo's 3. De lagen geïnduceerd door middel van centrifugeren is stabiel gedurende tientallen minuten.
7) Representatieve resultaten
Als het centrifugeren werkte zoals verwacht, zal de grote embryonale organellen uit sorteren op dichtheid van 2. Zo zal de low-density lipide druppels zich ophopen aan het voorste einde, de high-density eigeel blaasjes zal ophopen op het achterste einde (figuur 1, 2). Lipide druppels en dooier blaasjes zijn opslag organellen voor lipiden en voor eiwitten.
Bevestiging van de dichtheid-afhankelijke stratificatie is bereikt door visuele inspectie van de levende embryo's door transilluminatie onder een dissectie of compound microscoop. De embryo's moeten worden weergegeven als in figuur 5A: De lipide druppels zal een stevige bruine laag op het voorste puntje (een "lipide cap") te vormen, dooier accumulatie zal in een donker grijze zone resultaat aan het achterste einde. Deze twee donkere lagen worden gescheiden door een brede zone duidelijk dat ook andere organellen en cytoplasma vertegenwoordigt. Als embryo's worden gecentrifugeerd na cellularization, zal gelaagdheid minimaal zijn (figuur 5C).
Als een epifluorescentiemicroscoop beschikbaar is, kunnen deze levende, gecentrifugeerd embryo's worden onderzocht op onder UV-excitatie. Onder deze omstandigheden, de dooier toont intens blauwe autofluorescentie (Figuur 5B). Een compacte laag van autofluorescente materiaal op de achterste paal geeft succesvolle centrifugeren en dient als een marker voor het achterste einde.
Merk op dat de verschijning van deze lagen drastisch zal veranderen als de embryo's vast. Bijvoorbeeld, wanneer embryo's worden vastgesteld door standaard warmte-of formaldehyde fixatie gevolgd door heptaan-methanol devitellinization 1, lipide druppels worden doorzichtig en de lipide laag verschijnt wittig en pluizig door fel licht microscopie, in plaats van donkerbruin (Figuur 5D). Yolk autofluorescentie is gedeeltelijk of volledig verwoest door fixatie, en werd veel minder intens of zelfs niet op te sporen.
Als in-vivo centrifugeren is gebruikt om een bepaalde organellen hoogtepunt, is het nuttig om het etiket dat organel met een fluorescente marker voor bevestiging. Bijvoorbeeld, YFP fusie-eiwitten gericht op mitochondria, de ER of het Golgi beschreven 4. In gecentrifugeerd embryo's, deze markers zich ophopen op karakteristieke standen langs de voorste achterste as (figuur 1). Tot slot, sommige histon-fusie-eiwitten te lokaliseren zowel lipide druppels en kernen 2, en kan dus worden gebruikt om deze cellulaire compartimenten (figuur 5 E, F) en merk het stadium van het embryo monitor (door het aantal van gelabelde kernen) . Vliegen stammen de uiting van de markers in deze paragraaf genoemde zijn verkrijgbaar bij de Bloomington Drosophila voorraad centrum (http://flystocks.bio.indiana.edu/). Voor histon H2Av, zowel GFP en mRFP varianten zijn beschikbaar 5, 6
Figuur 1. Scheiding van organellen door centrifugeren (gewijzigd na 2). Centrifugeren van oriented embryo resulteert in duidelijke gelaagdheid(Fel licht). Grote organellen zich ophopen op karakteristieke standen langs de voorste (up) - posterior (naar beneden) as: lipide druppels (gedetecteerd in vaste embryo's door Nile Red kleuring), endoplasmatisch reticulum, Golgi, en mitochondriën (gedetecteerd in levende embryo's via het YFP markers beschreven in de hoofdtekst), eigeel (ontdekt door autofluorescentie). De fluorescentie beelden werden overgenomen door confocale microscopie.
Figuur 2. Schematische weergave van embryo's.
A. Ei met eierschaal en de prominente ei filamenten (dorsale aanhangsels). Omdat de eischaal is niet doorschijnend, het ei gelijkmatig donker.
B. Ei met Chorion verwijderd. Aan het voorste einde (links), de micropyle zichtbaar is. Afhankelijk van de ontwikkelingsfase, zal het embryo in de vitelline membraan gelijkmatig donker bruin of tonen verschillende structuren. Zie Afbeelding 4 voor voorbeelden.
C. gecentrifugeerd embryo, georiënteerd zoals in het protocol hier beschreven. Lipide druppels accumuleren als een bruin "cap" op het micropyle einde; dooier vormt een grijze laag op of in de buurt de andere kant.
Figuur 3. Schematische beschrijving van de procedure. Links: Embryo's zonder chorion worden geplaatst op de top van een agarplaat en duwde met een naald in gaten in de agar. Deze montage resulteert in een consistente oriëntatie van alle embryo's, met een anterior eindigt. Rechts: Na het centrifugeren, de embryo's zijn gelaagd. Agar is bedekt met TSS (blauw), en embryo's worden gewonnen uit de agar met de naald. Eenmaal opgehangen in TSS, kunnen embryo's worden opgehaald met een pipet.
Figuur 4. Bright-lichtbeelden van het leven Drosophila embryo's, vergelijkbaar met hoe ze zullen verschijnen in stap 4.1. Embryo's worden weergegeven in standaard oriëntatie: voorste einde naar links, achterste einde naar rechts, dorsale kant naar boven, en de buikzijde naar beneden. Een time-lapse film van de vroege embryogenese is beschikbaar als onderdeel van de video bij dit protocol.
A. Splitsing stadium embryo's gelijkmatig bruin. Stages als deze zijn ideaal voor in-vivo centrifugeren.
B. blastoderm embryo's hebben een duidelijke rand die verschijnt gelijk aan alle kanten. Deze duidelijke periferie is voor een deel te wijten aan accumulatie van kernen op het plasmamembraan en voor een deel te wijten aan binnenlands vervoer van de dooier blaasjes en lipide druppels 7. Deze duidelijke periferie uitbreidt tot aan het einde van cellularization 1. Embryo's kunnen nog met succes gestratificeerd worden door middel van centrifugeren tot het einde van cellularization 8, maar gelaagdheid van dooier en kernen niet zo consistent als in decollete fasen.
C. Na cellularization, embryo's lijken asymmetrisch zijn, dorsale en ventrale zijden worden onderscheiden, en diverse plooien te ontwikkelen. De getoonde embryo is in het begin van kiem-band toestel. In deze fasen, centrifugeren is niet langer effectief in het stratificeren van de belangrijkste organellen.
Figuur 5. Gecentrifugeerd embryo's. Alle embryo's in deze figuur werden gecentrifugeerd met hun voorste uiteindelijk en zijn weergegeven in die richting.
A. Bright-licht beeld van een succesvol gecentrifugeerd embryo. Een bruine laag op het voorste uiteinde is het gevolg van lipide-droplet accumulatie. Een brede grijze laag nabij het achterste uiteinde is te wijten aan dooier blaasjes. Er is vaak een heldere zone onder de dooier laag, van onbekende oorsprong. Een gelige zone is vaak zichtbaar boven de dooier laag, is het waarschijnlijk vertegenwoordigt mitochondriën. Oplosbare eiwitten worden gevonden door de heldere laag tussen lipide druppels en eigeel 2.
B. Het embryo in A bekeken door epifluorescentie microscopie onder UV-excitatie. De blauwe autofluorescentie kenmerk van eigeel helpt bij het identificeren van de achterste einde.
C. Embryo gecentrifugeerd tijdens de kiem-band toestel, dat wil zeggen, na cellularization. Dooier kan nog steeds accumuleren aan het achterste einde, maar voor de rest lagen is minimaal.
D. succes gestratificeerd embryo, na warmte fixatie. De lipide-droplet laag verschijnt wit en pluizig, in plaats van donkerbruin als in niet vastgelegde embryo's (A).
E. & F. Embryo uiten His2Av-GFP en afgebeeld door confocale microscopie (gewijzigd na 2). E: gecentrifugeerd bij decollete stadia, His2Av-GFP lijkt alleen markeren de lipide-laag druppel sinds enkele kernen zijn gevormd door deze tijd. Afhankelijk van de focal plane, mag kernen zichtbaar worden net onder de druppel laag (hier niet afgebeeld). F: gecentrifugeerd bij blastoderm stadia, His2Av-GFP markeert zowel het lipide-droplet laag (boven) en kernen (in een brede zone onder de druppel laag).
Discussion
Kritische stappen
Zorg ervoor dat de agar concentratie hoog genoeg is. Als het te laag is, zal de agar uiteen tijdens het centrifugeren, en de embryo's zullen barsten of worden willekeurig georiënteerd zijn. Als de agar concentratie is net iets te laag is of als de agar nat is (onvoldoende gedroogd of onvoldoende verwijdering van overtollig TSS in stap 4.3), zal de embryo's uit hun holen drijven tijdens het centrifugeren en worden niet goed georiënteerd. Als de agar is te dun gegoten, zal het ook instorten of barsten tijdens het centrifugeren.
Zorg ervoor dat de embryo's niet zijn gevorderd dan cellularization stadia. Anders zal de scheiding van organellen niet werken (Fig. 5C) sinds organellen zal worden afgezonderd in duizenden individuele cellen. Bij jongere embryo's aan de ene cel stadium, organellen zijn vrij om grote afstanden migreren en accumuleren volgens hun karakteristieke dichtheid. Om te voorkomen dat het analyseren van embryo's die te oud zijn, zorg ervoor dat (i) een pre-collectie om vrouwtjes aan oude eieren (stap 2.4), (ii) embryo's te verzamelen voor 3 uur of minder (stap 2.5), (iii) te leggen visuele wijze te selecteren embryo's voor cellularization podia voor inbedding in agar (stap 4.2), (iv) houdt inbedding de tijd kort is om ontwikkeling te voorkomen tot het einde van cellularization (stap 4.6), en (v) op de juiste gooi embryo's die niet laag (stap 5.6) .
Niet beknibbelen op de centrifugeertijd. Hoewel sommige van de embryo's mooie gelaagdheid vertonen zelfs na slechts 10 minuten van centrifugeren, de scheiding is inconsistent van embryo tot embryo. 30 min spins geven zeer consistente resultaten. Ook, hoe langer de centrifugeertijd, des te langer de lagen zijn stabiel na het centrifugeren is beëindigd. Dit is belangrijk voor toepassingen waar het kost tijd om de embryo's proces verder voor gebruik (bijv. als ze moeten worden verwerkt voor transplantatie-experimenten of gemonteerd voor confocale analyse).
Eventuele wijzigingen
Ei-inzameling en verwijdering van chorion veel verschillende protocollen bestaan voor de stappen 2 en 3 1, 3, 9, en zal evenals het werk van de die hier beschreven, zolang de gebruikte embryo's zijn jong, ei-opbrengst is hoog, en de fractie van mis- geënsceneerde embryo's wordt geminimaliseerd.
Anterior-posterior uitlijning Het protocol richt alle embryo's zodanig dat het achterste uiteinde is begraven in de agar en het voorste einde is omhoog (afb. 3). Deze oriëntatie is goed voor de consistentie, zodat het mogelijk is om de micropyle te gebruiken als een mijlpaal, die uiteindelijk wees tijdens het centrifugeren (afb. 1, 5). Echter, met de praktijk, is het gemakkelijk te halen uit de oriëntatie van de gecentrifugeerd embryo's door het aparte verschijning van de lipide-druppel en eigeel lagen door helder-veld microscopie. Dan wordt het mogelijk om embryo's te monteren met de uiteinden omhoog; deze flexibiliteit versnelt de montage proces.
Unoriented centrifugeren De meest tijdrovende en technisch uitdagende aspect van het protocol is het monteren van de embryo's in agar (stap 4). Het vereist het aanraken van elk embryo twee keer (een keer om te plaatsen in het gat en een keer om het te herstellen na centrifugeren). Als alternatief, kan een overdracht van embryo's bij stap 4.1 in microcentrifugebuizen gevuld met TSS. Wanneer deze buizen worden gecentrifugeerd in een microcentrifuge (13.000 rpm, 10-30 min), embryo's zullen ook meestal goed laag 10-13. Deze variatie maakt het mogelijk om honderden embryo's verwerken op hetzelfde moment heel snel. Echter, gelaagdheid is niet zo consistent, een fractie van de embryo's niet verschillende lagen te ontwikkelen, ondanks een veel hogere centrifugeren krachten (~ 16.000 g) dan toegepast in het protocol hierboven. Grotere uitdaging is het feit dat de oriëntatie van de embryo's variabele is, en men kan scheiden waarnemen in verschillende hoeken naar de grote embryo-as. Deze variabiliteit vereist dat de onderzoeker uit te sorteren na het centrifugeren hoe een bepaald embryo was geregeld in de centrifugebuis. Met het gebruik van de dooier autofluorescentie als een marker voor de meest dichte deel van het embryo, dat is het vaak mogelijk, maar het vereist veel oefening en meer betrouwbaar oordeel te doen. Als er voldoende embryo's in de steekproef, kan men in staat zijn om uit te zoeken die gevallen waarin embryo's gebeurd geregeld worden zoals in Fig. 1.
Centrifugeren van embryo's in hun eischaal Het is mogelijk om embryo's te verankeren in agar voor stap 4, zonder het verwijderen van het chorion eerste 2. In deze benadering worden embryo's op de collectie plaat bedekt met halogene olie in plaats van 50% bleekmiddel in stap 3.2 (halogene draait het chorion doorschijnend). Embryo's van passende stadia worden geselecteerd en overgebracht naar een nieuwe agarplaat met een pincet, door het pakken alleen het ei filamenten met het pincet, schade aanhet embryo juiste is vermeden. Embryo's worden ingebed als in stap 4.4 door middel van 4,8, met de voorste ei filamenten steken omhoog uit het gat in de agar. De eierschaal wordt verwijderd door 50% bleekmiddel behandeling na de embryo's zijn gecentrifugeerd en gegraven uit de agar zoals in stap 5.4. Centrifugatie in aanwezigheid van de eierschaal kan het verbeteren van de snelheid van devitellinization na fixatie (stap 6.2), maar de selectie van de juiste podia voor centrifugeren (stap 4.2) is een grotere uitdaging.
Toepassingen
Embryo centrifugeren is vooral nuttig voor colocalization experimenten, dat wil zeggen, om te testen of een bepaald eiwit lokaliseert om een bepaalde grote organel. Bijvoorbeeld, de Klar eiwit aanwezig is op de vroege embryonale lipide druppels, is maar deze lokalisatie uitdagend om aan te tonen in intacte embryo's. Voor een deel komt dit doordat zowel Klar puncta en lipide druppels zijn er in overvloed in het embryo periferie 10, het maken van valse colocalization moeilijk uit te sluiten. Echter, centrifugeren concentreert lipide druppels in een aparte laag, en dus, colocalization met Klar signaal duidelijk wordt 10.
Soortgelijke analyse heeft ondubbelzinnig aangetoond dat de lokalisatie van andere eiwitten aan lipide druppels 8, 13-15, met inbegrip van verrassende voorbeelden zoals bepaalde histonen 2 en in gevallen waarin een eiwit aanwezig is alomtegenwoordig, maar verrijkt op lipide druppels 8. Omdat embryo's kunnen visueel worden geselecteerd door de ontwikkelingsfase (stap 4.2), is het zelfs mogelijk om op ontwikkelingsgebied geregeld werving van eiwitten te detecteren om lipide druppels 8, 15. Testen op colocalization met lipide druppels is bijzonder eenvoudig omdat lipide druppels hopen zich op in een visueel duidelijke "cap", dus geen verdere marker of vlek is vereist om deze laag te identificeren. In feite, omwille van het gemak en mogelijk opvallende visuele resultaten (fig. 1, Fig. 5 D, E), ons laboratorium maakt gebruik van deze techniek nu routinematig als een eerste test of een kandidaat-eiwit is gelokaliseerd aan lipide druppels. In principe moeten dergelijke studies colocalization werk voor de andere organellen in Fig. 1, en waarschijnlijk voor anderen (waaronder intracellulaire parasieten), waarvan de distributie in gecentrifugeerd embryo's moet nog worden gedocumenteerd.
Sinds centrifugeren concentreert zich organellen in strakke bands, vergemakkelijkt de isolatie van een fractie verrijkt met deze organellen. Deze aanpak is al gebruikt om lipide druppels te herstellen voor transplantatie in donor embryo's 2. Het kan ook mogelijk zijn om biochemisch te analyseren de verrijkte fractie (bijvoorbeeld door te snijden lagen uit embryo's na fixatie 15).
De hier beschreven methode heeft toepassingen buiten Drosophila embryo's, zoals centrifugering kan worden gebruikt om de eieren van vele verschillende soorten (waaronder kikkers, nematoden, manteldieren, ringwormen, zee-egels, weekdieren, en Neteldieren) 16 stratificeren. In ons eigen laboratorium, hebben we het gebruikte protocol hierboven voor embryo's van de huisvlieg Musca domestica 2 en werkzaam unoriented centrifugeren in de analyse van embryo's uit de schimmel mug Sciara coprophila 17 en de slak Ilyanassa obsoleta 17. Tot slot, is deze methode niet beperkt tot embryo's: Centrifugeren kan ook nuttig zijn om andere grote cellen, zoals eicellen (bijvoorbeeld in Drosophila 2, 18 en de kroontjeskruid bug Oncopeltus fasciatus 17) stratificeren. Voor verschillende specimen, de exacte centrifugeren voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd: bijvoorbeeld 10 minuten bij 3000 g is voldoende om efficiënt te stratificeren embryo's van Musca domestica 2, en zo veel langer gecentrifugeerd, de embryo's hebben de neiging om uit elkaar te breken tijdens de fixatie en immunokleuring.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Susan Gerbi, Heidi Smith en David Lambert voor het leveren van materiaal om in-vivo test op centrifugeren Sciara coprophila en Ilyanassa obsoleta, respectievelijk. Wij danken de leden van de Welte lab voor commentaar op de techniek en manuscript. Ontwikkeling en verfijning van de in-vivo centrifugatie test werd gesteund door NIGMS verlenen GM64687 aan MAW. De beelden getoond in Fig. 1 en Fig. 5E, werden F eerder gepubliceerde 2 en worden hier met toestemming overgenomen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60x15 mm Petri dishes | BD Biosciences | #35-1007 | From Falcon |
| Wire mesh | Small Parts, Inc. | CX-0150 | stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | 0.25 mm |
| Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Fly Cages | Genesee Scientific | 59-100 or 59-101 | For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 |
References
- Roberts, D. B. Looking at embryos. Drosophila: A Practical Approach. , 2nd Edition, University Press. Oxford. 179-214 (1998).
- Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot. Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A. Quantitative microinjection of Drosophila embryos. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 345-359 (2000).
- LaJeunesse, D. R. Three new Drosophila markers of intracellular membranes. Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase. Curr Biol. 17, 237-243 (2007).
- Clarkson, M., Saint, R. A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior. DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).
- Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics. Cell. 92, 547-557 (1998).
- Tran, S. L., Welte, M. A. unpublished observations. , Forthcoming.
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Fluorescent analysis of Drosophila embryos. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 141-157 (2000).
- Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar. Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).
- Meyer, W. J. Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos. PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).
- Shubeita, G. T. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Welte, M. A. Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2. Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).
- Phadnis, N., Welte, M. A. Unpublished Observations. , Forthcoming.
- Phadnis, N., Welte, M. A. Unpublished Observations. , Forthcoming.
- Morgan, T. H. Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging. Experimental Embryology. , Columbia University Press. New York. (1927).
- Welte, M. A. Unpublished Observations. , Forthcoming.
- Bownes, M. Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females. J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).
