德罗索菲拉 求爱条件：一种测试苍蝇学习和记忆的方法

Overview

这个视频描述了一个经典的调理分析，测试学习和记忆在 德罗索菲拉，称为求爱调理。该检测基于男性在遭受不接受的预谋女性的拒绝后减少求爱。示例协议显示了可用于评估短期和长期内存的程序设置。

Protocol

本协议摘自科曼斯 等人， 德罗索菲拉 求爱条件作为学习和记忆的衡量标准 ，J.Vis.Exp.（2017 年）。

注： 在下面概述的协议中，描述了收集、培训和测试的复制品。为了测试结果的可重复性，这些步骤应在多天内并行重复，并单独使用一组苍蝇（表 1）。该协议基于从卵子到成人的10天生命周期，这是正常的，当饲养苍蝇在恒定的条件下25°C，70%的湿度，和12小时的光/暗周期。此协议的所有方面都假定条件在整个检测过程中保持不变。时间指示为在孵化器灯打开 （BLO） 或灯打开 （ALO） 后数小时，因为根据研究人员一天中首选的时间，可以方便地设置时间。使用二_氧化碳 气体只用于最初收集天真的雄性苍蝇和收集预制雌性苍蝇。求爱条件协议由以下步骤组成：

1. 建立早熟的女性收藏文化
2. 建立收集男性测试科目的文化
3. 住房区块的准备
4. 建立交配小瓶，用于生产标准化的预产雌性
5. 男性测试科目集合
6. 训练
7. 测试
8. 视频数据分析和统计

1. 建立预先建立的女性收藏文化

1. 准备动力食品。煮 0.8% （w/v） 阿加， 8% （w/v） 酵母， 2% （w/v） 酵母提取物， 2% （w/v） 肽， 3% （w/v） 蔗糖， 6% （w/v） 葡萄糖， 0.05% （w/v） MgSO_4，和 0.05% （w/v） CaCl₂ 在水中 15 分钟。允许溶液冷却到 70 °C，然后加入 0.05% （w/v） 甲基苯丙烯 （警告： 有毒） 和 0.5% （v/v） 丙酸 （警告： 有毒）。搅拌均匀混合，同时进一步冷却至50°C，以获得均匀的溶液。
2. 在食物在室温下凝固之前，在每175mL塑料瓶中加入约50mL的动力食品。让食物进一步冷却。用插头关闭小瓶。
   注： 强力食品是专门为生产大量苍蝇而配制的一种专用食品混合物，大概是通过诱导产卵。强力食品不用于生产用于行为分析的雄性苍蝇（第 2 步），因为非典型饮食和潜在的拥挤可能会影响发展。
3. 在-11日（表1），开始5-20野生型文化与约60-100只苍蝇（雄性与雌性混合）在动力食品小瓶：这些将在第4步用于生产标准化的预制女性。在每个小瓶中加入一个滤纸，以增加幼虫可以幼崽的面积：这将增加可以关闭的苍蝇数量。
4. 在整个实验中定期重复步骤1.1-1.3，以获得足够的新关闭苍蝇作为输入"建立交配小瓶，以生产标准化的预制雌性"（第4步）。

2. 建立男性测试科目集合文化

1. 准备普通食物，用0.5%（w/v）阿加制成， 2.75% （w/v） 酵母， 5.2% （w/v） 玉米粉， 11% （w/v） 糖， 0.05% （w/v） 甲基苯丙烯， 和 0.5% （v/v） 丙酸在水中， 如步骤 1.1 和 1.2 所述.用飞瓶插头关闭 175 mL 塑料小瓶。
2. 在-10日（表1），放置约10-20名男性与约30-75处女女性（材料/设备表）在每175 mL小瓶含有正常食物。添加滤纸，以增加幼崽的表面积，并最大限度地提高生产率。
3. 建立三到六个175mL小瓶每个基因型，以获得所需的测试对象男性数量。
   注： 可能需要更多小瓶，具体取决于所需的基因型的生产率。

3. 准备住宅区 （图2A）

1. 将大约 50 mL 的电源食品融化在微波炉中，或将其重新准备。
2. 使用多分散式移液器，在 96 井平底块的每口井中加入 500μL 的动力食品。
3. 让食物在室温下凝固。
4. 用 PCR 胶粘膜覆盖方块，并用针头每口井至少打 4 个孔，为苍蝇提供新鲜空气。
5. 为了能够打开每口井，使用剃须刀刀片在每排之间长距离切割胶卷。将胶片完好无损地留在方块的一端。
6. 这些方块可在 4 °C 下存储长达 2 天。
   注： 允许块在使用前重新平衡到室温。

4. 建立交配小瓶，用于生产标准化的预产雌性

1. 在第 -1 天，以 2-5 h BLO 的速度从预制的女性收藏文化中移除和丢弃所有成人野生类型苍蝇。
2. 使用吸气器（图2B）在2至3小时间隔内（例如， 在30分钟、2.5小时和5小时ALO）中收集这些小瓶中的苍蝇，并将它们放在一个新的动力食品瓶中，并辅以少量酵母糊和滤纸。
3. 为了避免拥挤和促进最佳交配气氛，不要将超过150-200只苍蝇转移到每个新小瓶。通过提供至少 25% 的男性，确保所有女性的交配。确保交配小瓶中有足够的雌性，以适应实验的大小。
   注： 由于这是协议中的关键一步，请确保只有刚刚关闭的苍蝇和没有老苍蝇，幼虫，或幼虫转移到新的交配小瓶。
4. 将这些"交配小瓶"孵化四天，让所有女性有足够的时间交配。

5. 男性测试科目集合

1. 在第1天（表1）在2-3小时BLO，使用CO₂ 从雄性收集小瓶（第2步）去除所有成年苍蝇，但让更多的苍蝇在未来几个小时内关闭。
2. 在接下来的 5-6 小时内，使用_CO 2 每 20-30 分钟取出一次新关闭的苍蝇，并使用吸气器 （图 2B）将每个男性放入住宅区块的单独井中（第3步）。
3. 用胶粘剂 PCR 薄膜重新密封油井。
   注： 这是协议中的关键一步。男性应该经常收集。收集的雄性应隔离在接近截止时间的外壳中，当它们表现出苍白的色素沉着和半透明腹部中存在甲基苯甲酸。
   注： 温柔地使用吸气器可以转移苍蝇：然而，不当使用会给苍蝇带来压力，导致检测结果出现差异（参见讨论）。
4. 目标是收集多达48个男性每个基因型。这为分析天真和训练有素的条件所需的男性人数提供了少量的过剩，从而在以后的转移步骤中造成一些损失。

6. 培训

1. 使用 CO₂ 将苍蝇从交配小瓶（第 4.2 步）中取出，并将预制雌性与雄性分离。
2. 使用吸气器，在新住宅区一排的每个井中添加一个麻醉的预制女性。
3. 使用吸气器和没有麻醉，将一个天真的男性从第5.2步设置的住宅区转移到含有预产女性的井中。雄性放入井中后，立即用胶卷重新密封：不允许男性逃跑。
   注： 利用雄性苍蝇的自然"负地缘"行为，将雄性苍蝇从吸气器转移到住宅区。
4. 重复步骤 6.2-6.3，直到建立足够的男女对。理想情况下，建立24对，两排完整的住房块，每个基因型。将剩余的天真男性留在第 5.2 步设置的原始住宅区中。
5. 在训练期间，男女配对不受干扰（表2，图1B）。
   注： 在此期间，男性将出庭受审，并被预谋的女性拒绝。对于学习和 STM，培训期为 1 小时，对于 LTM，培训期为 7-9 小时。
6. 结束训练（表2，图1B），使用吸气器轻轻地将男性与预谋的女性分开：不要使用麻醉。将分离的男性安置在新的住宅区。
7. 使用渴望者将所有天真的男性从第 5.2 步设置的住宅区轻轻地、没有麻醉地转移到新的住宅区。
   注： 这一步是可选的STM和学习，但它是非常重要的LTM，因为苍蝇被安置了额外的24小时来测试LTM。
8. 对于STM和LTM，允许男性在测试前分别休息1小时和~24小时（表2，图1B）（第7步）。
9. 为了学习，立即测试训练有素和天真的男性（第7步）。

7. 测试

1. 使用 CO₂ 从交配小瓶（第 4.2 步）收集苍蝇，并将预制雌性与雄性分开。
2. 让女性在含有正常食物的小瓶中从麻醉中恢复至少1小时。
3. 提前安装录像机（图2C），以便在测试开始前准备好所有设备。
4. 根据学习、STM 和 LTM 的不同时间线（表 2，图 1B）开始测试。培训后立即进行学习测试，STM 培训后 1 小时，LTM 培训后 24 小时。
5. 使用吸气器，如果学习正在测试（步骤6.7，训练;步骤6.8，天真），轻轻地将男性从休息的住房区或训练住房区转移到一个封闭的求爱竞技场的一半（图2D：见建筑计划文件S1）。
   注： 使用自然的"负地缘"行为应该足以将雄性苍蝇从渴望者转移到求爱的舞台上。
6. 快速但轻轻地将入口孔移动到下一个竞技场，并重复步骤 7.5，直到所有 18 个竞技场包含一个男性。
7. 使用吸气器，没有CO_2，添加一个预制女性（收集在第7.2步）到所有18个竞技场的另一半。
8. 小心地将求爱室放在摄像机下，打开井朝下（图2C）。
9. 移除竞技场的隔板，允许男性和预产期女性之间的直接互动。
10. 立即开始记录行为至少10分钟。
    注： 使用双摄像头设置时，可以在重叠的时间范围内对两个求爱板进行并行记录，以最大限度地提高效率。
11. 使用手持式吸尘器清空求爱场所，让求爱室在重新使用前通风。
12. 重复步骤 7.4-7.11，直到完成所有基因型和条件（即 天真和训练）的测试。

8. 视频数据分析和统计

1. 计算求爱指数 （CI），定义为男性法院在测试期前 10 分钟为每只雄性苍蝇的时间百分比。
   注： 这可以通过观察陈规定型求爱行为（图1A）或使用计算机软件自动量化求爱行为来手动完成。
   注： 建议在三天内分析每种情况的40-60名男性，以便获得足够的统计能力并判断CI数据的一致性。
2. 计算学习指数（LI），定义为训练有素的男性与天真男性（LI=（CI_天真=CI训练）/CI_天真）相比，训练_有素的男性平均CI的百分比降低百分比。评估 LI 的每一天测试，并将其与所有测试日组合计算的累积 LI 进行比较。
3. 制作一个单独的两列选项卡数据文件，标题为"Genotype"和"CI"。
   注： 这些标题对案例很敏感。每个 CI 的基因型名称必须包括基因型的描述，然后是下划线和训练条件（例如，genotype_N 和genotype_LTM等，其中 N = 天真和 LTM = 长期记忆;例如，参见补充文件 S2）。此注释至关重要，因为 analearn 的功能将根据"Genotype"列中第一个下划线后出现的字符识别训练有素和天真的苍蝇。
4. 使用 analearn R 脚本 （补充文件 S3） 执行随机化测试，以判断 LI 值与不同基因型之间的差异的统计意义。
   1. 将脚本（补充文件 S3）源入 R，该 R 定义了称为"analearn"的功能。
      注： 函数定义为：analearn=lt：-函数（nboot=10，000，天真='N'，重新改变=NA，数据名=NA，标题=真实，种子=NA，注销=真实）。
   2. 通过在 R 命令行中输入"analearn（）"并开始功能，并选择要通过弹出窗口分析的数据文件（以步骤 8.3 生成）。
   3. 通过输入相应的数字并按下输入，选择参考突变（即控制基因型）。
      注： 选择参考基因型后，脚本需要几秒钟才能执行 10，000 个引导器复制。
   4. 观察输出表（表 3），其中包含基因型、学习条件（即学习、STM 或 LTM），表示 CI 天真，表示 CI 训练，LI，与实验条件 （LI dif）、LI dif 95% 置信区间的下限 （LL） 和上限 （UL） 之间的控制 LI 之间的差异，以及表示没有显著差异的概率的 p值。
      注 ：analearn 将在数据文件所在的目录中存储输出文本文件。但是，输出表也显示在 R-Studio 控制台中。默认名称是根据所提供的数据文件的名称构建的。
   5. 功能中有几个参数可用于更改函数的默认设置以调整引导的参数。
      注： "nboot"定义了引导器复制的数量，默认情况下设置为 10，000 个。此值可更改为大于零的任何整数。表 5 会征集几个参数，这些参数可用于更改函数的默认设置。但是，不建议使用使用低数量的引导复制生成的数据。

Representative Results

图1：求爱指数的确定和实验概述。 （A） 图像显示对雌性苍蝇的陈规定型男性求爱行为。显示求爱行为的不同阶段：方向（I）、跟随（II）、机翼振动（扩展）和敲击（III）、舔（IV）和尝试交配（V）。（B） 关于孵化器光周期的训练和测试时间的原理图概述，以小时为标志。训练时间用条形表示，STM 和 LTM 的休息时间指示为虚线，测试起点指示为箭头。请注意，LTM 的测试时间是培训后的第二天。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2：用于 德罗索菲拉 求爱调理分析的设备。 （A） 住宅区是一个平坦的底块，每口井有500μL的动力食品。它用 qPCR 胶卷密封，每口井至少有 4 个孔，这些孔是使用直径为 0.8 毫米的注射器针头制造的。单行使用剃须刀刀片将单行纵向切成条状，以便打开和关闭。（B） 在不使用麻醉的情况下，需要吸气器才能轻轻转移雄性苍蝇和雌性苍蝇。插图显示吸气器的尖端，用一块棉花关闭，以保持苍蝇在尖端。（C） 设置双摄像头系统，同时录制两个求爱室。（D） 一个有18个竞技场的求爱室。滑动入口孔用于将苍蝇放在竞技场上。可以同时打开白色分隔线，以启动男性和女性之间的互动。 请单击此处查看此图的更大版本。

表1：在单个日测试LTM超过三个复制的示例时间线。

	常规	收集	火车	测试
天-11	开始预制的女性收藏文化（第1.3步）
天-10	开始收集男性测试科目的文化（第 2.2 步）
第1天		代表 1
第2天		代表2
第3天		代表3
第4天		代表4	代表 1
第5天			代表2	代表 1
第6天			代表3	代表2
第7天			代表4	代表3
第8天				代表4
第9天	视频数据分析和统计（第 8 步）
代表=重复

表2：培训持续时间、培训时间和学习、STM 和 LTM 测试时间

	学习	性病	LTM
培训时间	1 小时。	1 小时。	8 小时
休息时间	0 小时。	1 小时。	~24小时
开始培训	0 h. 阿洛	0 h. 阿洛	4 小时布洛
停止培训	1 小时 ALO	1 小时 ALO	4 h. 阿洛
开始测试	1 小时 ALO	2 h. 阿洛	0 h. 阿洛 （第二天）
ALO=灯打开后，BLO=灯打开前，STM=短期内存，LTM=长期内存

表3：从阿诺伦脚本产生的统计数据。
从阿莱恩脚本生成的统计数据。包含基因型、学习条件（即学习、STM 或 LTM）的引导 R 脚本的输出文件，指 CI 天真，表示 CI 训练，LI，与实验条件 （LI dif）、LI dif 95% 置信区间的下限 （LL） 和上限 （UL） 之间的控制之间的差异，以及表明没有显著差异的概率的 p值。

基因型	学习	词	词	李	李	下限	上限	p 值
	条件	朴素	训练		差异	（95%的会合间隔）	（95%的会合间隔）
控制	性病	0.467	0.116	0.752	那	那	那	那
达普在雷奈	性病	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
控制	LTM	0.59	0.384	0.348	那	那	那	那
达普在雷奈	LTM	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

补充文件S1：求爱室的建设计划。 文件可以打开任何应用程序，允许.stp扩展（CAD文件）。 请单击此处下载此文件。

补充文件 S2：Analearn 脚本输入文件示例。请单击此处下载此文件。

补充文件S3：阿诺伦.R脚本。 该文件可以使用 R 工作室打开。 请单击此处下载此文件。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-