Дрозофила Кондиционирование ухаживания: метод для проверки обучения и памяти в мухах

Overview

Это видео описывает классический анализ кондиционирования, что тесты обучения и памяти в Drosophila, называется ухаживания кондиционирования. Анализ основан на сокращении мужских ухаживаний после того, как он испытывает отторжение со стороны не восприимчивой женщины. В примере протокола показана настройка процедуры, которая может быть использована для оценки кратковременной и долгосрочной памяти.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Koemans и др., Drosophila ухаживания кондиционирования как мера обучения и памяти, J. Vis. Exp. (2017).

ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе, изложенной ниже, описана одна репликация сбора, обучения и тестирования. Для того, чтобы проверить воспроизводимость результатов, эти шаги должны повторяться параллельно, в течение нескольких дней, и с отдельными группами мух(таблица 1). Протокол основан на 10-дневном жизненном цикле от яйца к взрослому, что нормально при воспитании мух при постоянных условиях 25 градусов по Цельсию, 70% влажности и 12 ч светло-темного цикла. Все аспекты этого протокола предполагают, что условия находятся в постоянном состоянии на протяжении всего анализа. Времена указаны как часы до включенных огней (BLO) или после того, как свет включается (ALO) в инкубаторе, так как это может быть удобно установлено в зависимости от предпочтительного времени суток исследователя. Используйте_ГАЗ CO 2 только для первоначального сбора наивных самцов мух и для сбора предварительной самки. Этот протокол для кондиционирования ухаживания состоит из следующих шагов:

1. Создание предварительной женской культуры коллекции
2. Создание культур для сбора мужских испытуемых
3. Подготовка жилых домов
4. Создание брачных флаконов для производства стандартизированных предварительной самки
5. Коллекция испытуемых-мужчин
6. тренировка
7. тестирование
8. Анализ видео данных и статистика

1. Создание сборных культур для женщин

1. Приготовьте продукты питания. Отварить 0,8% (ж/в) агар, 8% (w/v) дрожжи, 2% (w/v) экстракт дрожжей, 2% (w/v) пептон, 3% (w/v) сахароза, 6% (w/v) глюкоза, 0,05% (w/v) MgSO₄, и 0,05% (w/v) CaCl₂ в воде в течение 15 мин. Разрешить раствор остыть до 70 градусов по Цельсию, прежде чем добавлять 0,05% (ж / в) метилпарабен(CAUTION:токсичные ) и 0,5% (V /v) пропионовой кислоты (ВНИМАНИЕ: токсичные). Хорошо перемешать, помешивая при охлаждении до 50 градусов по Цельсию, чтобы получить однородный раствор.
2. Прежде чем пища затвердеет при комнатной температуре, добавьте 50 мл силовой пищи к каждому пластиковому флакону мощностью 175 мл. Дайте пище остыть дальше. Закройте флакон вилкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Powerfood является специализированной пищевой смесью, разработанной специально для производства большого количества мух, предположительно путем индуцирования откладывая яйца. Powerfood не используется для производства мужских мух, которые будут использоваться для анализа поведения (шаг 2), потому что нетипичная диета и потенциальная скученка может повлиять на развитие.
3. В день -11(таблица 1), начать 5-20 культур дикого типа с примерно 60-100 мух (смесь самцов и женщин) в powerfood флаконы; они будут использоваться в шаге 4 для производства стандартизированных предварительной женщины. Добавьте фильтровальную бумагу к каждому флакону, чтобы увеличить область, на которой личинки могут окукливаются; это увеличит количество мух, которые могут выкупить.
4. Периодически повторяйте шаги 1.1-1.3 на протяжении всего эксперимента, чтобы получить достаточное количество новых выкрывающих мух в качестве ввода для "установления брачных флаконов для производства стандартизированных предварительно разработанных самок" (шаг 4).

2. Создание культур для сбора мужских испытуемых

1. Приготовить нормальную пищу, с 0,5% (w/v) агар, 2,75% (w/v) дрожжей, 5,2% (w/v) кукурузная мука, 11% (w/v) сахар, 0,05% (w/v) метилпарабен, и 0,5% (v/v) пропионовая кислота в воде, как описано в шагах 1.1 и 1.2. Закройте 175-мл пластиковые флаконы с вилкой флакона мухи.
2. На день -10 (Таблица 1), место около 10-20 мужчин с примерно 30-75 девственных женщин (Материалы / Оборудование Таблица) в каждом 175 мл флакон, содержащий нормальную пищу. Добавьте фильтровальную бумагу, чтобы увеличить площадь поверхности для окукливания и максимизировать производительность.
3. Установить от трех до шести 175 мл флаконов на генотип, чтобы получить необходимое количество испытуемых мужчин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от производительности желаемого генотипа может потребоваться больше флаконов.

3. Подготовка жилых блоков(рисунок 2A)

1. Растопить около 50 мл powerfood на жилой блок в микроволновой печи, или подготовить его свежим.
2. Добавьте 500 йл силовой пищи к каждой колодец 96-ну, плоский нижний блок с помощью мультидиспенсерной пипетки.
3. Разрешить пищу затвердеть при комнатной температуре.
4. Обложка блоков с PCR клейкой пленкой и использовать иглу, чтобы сделать по крайней мере 4 отверстия на колодец, чтобы обеспечить свежий воздух для мух.
5. Для того, чтобы иметь возможность открыть каждый колодец, используйте лезвие бритвы, чтобы сократить клейкой пленки вдоль между каждым рядом. Оставьте пленку нетронутой на одном конце блока.
6. Блоки могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение 2 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешить блоки для повторного equilibrate до комнатной температуры до использования.

4. Создание брачных флаконов для производства стандартизированных женщин

1. На день -1, удалить и отказаться от всех взрослых диких мух из предварительной женской культуры сбора на 2-5 ч BLO.
2. Соберите мух с помощьюаспиратора (рисунок 2B) из этих флаконов в интервалах от 2 до 3 часов(например, при 30 мин, 2,5 ч и 5 ч АЛО) и поместите их в новый флакон powerfood, дополненный небольшим количеством дрожжевой пасты и фильтровальной бумаги.
3. Чтобы избежать скучения и способствовать оптимальной атмосфере спаривания, не перенесите более 150-200 мух на каждый новый флакон. Обеспечить спаривание всех женщин, предоставляя по крайней мере 25% мужчин. Убедитесь, что в брачных флаконах присутствует достаточное количество самок для размещения размера эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку это важный шаг в протоколе, убедитесь, что только свежевыбитые мухи и никакие старые мухи, личинки или куколки не переносятся на новый брачный флакон.
4. Инкубировать эти "брачные флаконы" в течение четырех дней, чтобы обеспечить достаточно времени для всех женщин, чтобы спариваться.

5. Коллекция мужских испытуемых

1. На 1 день (Таблица 1) на 2-3 ч BLO, использовать CO_{2, чтобы} удалить все взрослые мухи из мужской коллекции флаконов (шаг 2), но пусть больше мух выклюка в течение ближайших нескольких часов.
2. В течение следующих 5-6 ч, удалить недавно eclosed мух каждые 20-30 минут с использованием CO₂ и положить каждого мужчину в отдельный колодец жилого блока (шаг 3) с помощью аспиратора (Рисунок 2B).
3. Повторно загерметизировать колодец с клейкой пленкой ПЦР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг в протоколе. Самцы должны собираться часто. Собранные самцы следует изолировать в жилом блоке ближе к времени аклозии, когда они демонстрируют бледную пигментацию и наличие мекония в полупрозрачном животе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нежное использование аспиратора позволяет передавать мух; однако ненадлежащее использование будет подчеркивать мух, вызывая дисперсию в анализе (см. Обсуждение).
4. Цель собрать до 48 мужчин на генотип. Это обеспечивает небольшое превышение максимального числа мужчин, необходимых для анализа как наивных, так и обученных условий, что позволяет некоторые потери во время более поздних этапов передачи.

6. Обучение

1. Удалите мух из брачного флакона (шаг 4.2) с помощью CO₂ и отделить предварительно самок от самцов.
2. Используя аспиратор, добавьте одну анестезироватую, заранее подготовленную самку к каждому колодец в одном ряду нового жилого квартала.
3. Используя аспиратор и без анестезии, перенесите индивидуального наивного самца из жилого квартала, установленного в шаге 5.2, в колодец, содержащий предварительно подготовленную самку. После того, как самец помещается в колодец, немедленно запечатыв клейкой пленкой; не позволяйте мужчине бежать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Передача мужчины летит от аспиратора к жилому блоку, воспользовавшись их естественным "негативным геотаксисом" поведением.
4. Повторите шаги 6.2-6.3 до тех пор, пока не будет установлено достаточное количество мужских и женских пар. В идеале, установить 24 пары, два полных ряда жилого блока, на генотип. Оставьте оставшихся наивных самцов в первоначальном жилом блоке, настроенного в шаге 5.2.
5. Оставьте мужские и женские пары нетронутыми во время тренировочного периода(таблица 2, рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени, мужчина будет суд и быть отклонены предварительной женщины. Для обучения и STM, период обучения составляет 1 ч и для LTM, период обучения 7-9 ч.
6. Завершите обучение(таблица 2, рисунок 1B) с помощью аспиратора, чтобы мягко отделить самца от предварительной самки; не используйте анестезию. Поместите разлученного самца в новый жилой дом.
7. Используйте аспиратор для передачи всех наивных самцов мягко и без анестезии из жилого квартала, установленного в шаге 5.2, в новый жилой блок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным для STM и обучения, но это очень важно для LTM, потому что мухи размещены для дополнительных 24 ч для тестирования LTM.
8. Для STM и LTM, позвольте мужчинам отдохнуть в течение 1 ч и 24 ч, соответственно(таблица 2, рисунок 1B) перед тестированием (шаг 7).
9. Для обучения немедленно проверьте обученных и наивных самцов (шаг 7).

7. Тестирование

1. Собирайте мух из брачных флаконов (шаг 4.2) с помощью CO₂ и отделяйте самок от самцов.
2. Пусть самки оправиться от анестезии, по крайней мере 1 ч во флаконе, содержащем нормальную пищу.
3. Намонтировать видеомагнитофоны заранее(рисунок2C ), для того, чтобы все оборудование было готово до начала испытаний.
4. Начните тестирование в соответствии с различными сроками обучения, STM и LTM(таблица 2, рисунок 1B). Выполните тестирование сразу после обучения, 1 ч после тренировки для STM, и 24 ч после тренировки для LTM.
5. Используя аспиратор, аккуратно перенесите отдельного мужчину из жилого квартала отдыха или из учебного жилого квартала, если обучение проходит тестирование (шаг 6.7, обученный; шаг 6.8, наивный) на половину арены ухаживания с закрытым разделителя(рисунок 2D; см. Файл S1 для плана строительства).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование естественного поведения «негативного геотаксиса» должно быть достаточным для переноса самца мух из аспиратора на арену ухаживания.
6. Быстро, но осторожно переместить отверстие входа на следующую арену и повторить шаг 7.5 до тех пор, пока все 18 арен содержат один мужчина.
7. Используя аспиратор и без CO_2,добавьте одну самку (собранную в шаге 7.2) к другой половине всех 18 арен.
8. Аккуратно поместите камеру ухаживания под камеру, с открытием колодцев, обращенных вниз(рисунок 2C).
9. Удалите разделитель арен, чтобы обеспечить прямое взаимодействие между самцами и заранее самок.
10. Немедленно начните записывать поведение, по крайней мере 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании установки двух камер параллельная запись двух ухаживающих пластин может быть выполнена в перекрывающихся таймфреймах для максимизации эффективности.
11. Пустые ухаживания аренах с помощью ручного пылесоса и позволяют ухаживания камеры для вентиляции перед повторного использования.
12. Повторите шаг 7.4-7.11 до тех пор, пока не будет завершено тестирование всех генотипов и условий(т.е. наивных и обученных).

8. Анализ и статистика видеосъемок

1. Рассчитайте индекс ухаживания (CI), определяемый как процент времени, которое суды-мужчины в течение первых 10 минут испытательного периода, для каждого отдельного мужчины летать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать вручную, наблюдая стереотипное поведение ухаживания(рисунок 1A) или с помощью компьютерного программного обеспечения для автоматизированной количественной оценки поведения ухаживания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проанализировать 40-60 мужчин на состояние в течение трех дней, с тем чтобы достичь достаточной статистической мощности и судить о согласованности данных КИ.
2. Рассчитайте индекс обучения (LI), определяемый как процентное снижение среднего CI обученных мужчин по сравнению с наивными мужчинами (LI q (CI_наивно - CI_{обученный}) / CI_{наивный}). Оцените LI за каждый день тестирования и сравните его с кумулятивным LI, рассчитанным из всех дней тестирования вместе взятых.
3. Сделайте отдельный файл данных вкладки с двумя столбцами с "Генотип" и "CI" в качестве заголовых.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти заголовки чувствительны к делу. Название генотипа для каждого КИ должно состоять из описания генотипа с последующим подчеркиванием и условием обучения(например, genotype_N и genotype_LTM и т.д., где N и LTM - долгосрочная память; см. Дополнительный файл S2 для примера). Эта аннотация имеет важное значение, так как функция analearn будет определять обученных и наивных мух на основе символов, присутствующих после первого подчеркнуть в "Генотип" колонке.
4. Используйте сценарий analearn R (Дополнительный файл S3) для проведения теста рандомизации, чтобы судить о статистической значимости различий между значениями LI от различных генотипов.
   1. Источник скрипта (Дополнительный файл S3) в R, который определяет функцию, называемую "analearn".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определение функции: analearn lt;- функция (nboot - 10,000, naivelevel - 'N', refmutation - NA, datname - NA, заголовок - TRUE, семя - NA, writeoutput - TRUE).
   2. Запустите функцию, введя "analearn()" в командной строке R и выбрав файл данных для анализа (производится в шаге 8.3) через всплывающее окно.
   3. Выберите эталонную мутацию, которая является контрольный генотип, введя соответствующее число и нажав введите.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После выбора эталонного генотипа, сценарий занимает несколько секунд, чтобы выполнить 10000 загрузок.
   4. Соблюдайте таблицу вывода (Таблица 3), которая содержит генотип, состояние обучения(т.е.обучение, STM, или LTM), среднее CI наивное, среднее CI обучение, LI, разница между LI управления по сравнению с экспериментальным состоянием (LI dif), нижний предел (LL) и верхний предел (UL) 95% интервал доверия LI dif, и p-значение,указывающее на вероятность того, что нет существенной разницы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: analearn будет хранить текстовый файл вывода в каталоге, где находится файл данных. Тем не менее, выходная таблица также отображается в консоли R-Studio. Имя по умолчанию построено на основе названия предоставленного файла данных.
   5. Есть несколько аргументов в функции analearn, которые могут быть использованы для изменения параметров по умолчанию функции для корректировки параметров загрузки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: "nboot" определяет количество репликаций загрузки и устанавливается до 10000 по умолчанию. Это значение может быть изменено на любое число, большее, чем ноль. Таблица 5 завербовыв несколько аргументов, которые могут быть использованы для изменения параметров по умолчанию функции. Тем не менее, не рекомендуется использовать данные, которые производятся с низким количеством репликаций загрузки.

Representative Results

Рисунок 1: Определение индекса ухаживания и экспериментального обзора. (A) Изображения, показывающие стереотипное поведение мужских ухаживаний по отношению к женской мухе. Показаны различные стадии ухаживания: ориентация (I), следовающая (II), вибрация крыла (расширение) и постукивание (III), лизание (IV) и попытка совокупления (V). (B)Схематический обзор времени обучения и тестирования по отношению к циклу света инкубатора, отмеченного в часах. Время обучения указывается барами, периоды отдыха для STM и LTM обозначены пунктирной линией, а точка начала тестирования указана как стрелка. Обратите внимание, что время тестирования LTM на следующий день после тренировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Оборудование, используемое для Drosophila ухаживания кондиционирования анализа. (A)блок снабжения жилищем плоский, нижний блок с 500 l powerfood в наилучшим образом. Он запечатан клейкой пленкой qPCR с по крайней мере 4 отверстиями на колодец, которые были созданы с помощью шприца иглы с диаметром 0,8 мм. Отдельные ряды разрезаются вдоль на полоски с помощью лезвия бритвы, чтобы открыть и закрыть. (B)Аспиратор необходим для нежной передачи самцов и самок мух без применения анестезии. Вставка показывает кончик аспиратора, закрытый куском хлопка, чтобы держать мух в кончике. (C)Установка двухкамерной системы для одновременной записи двух ухаживаний камер. (D)Ухаживая камера с 18 аренами. Раздвижные отверстия входа используются для места мух на аренах. Белые разделители могут быть одновременно открыты для инициирования взаимодействия между самцами и самками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Пример Хронология для тестирования LTM в течение трех репликаций в отдельные дни.

	Общее	собирать	поезд	тест
день -11	Начало предварительной женской коллекции культур (шаг 1.3)
день -10	Начало культур для сбора мужских испытуемых (шаг 2.2)
день 1		респ. 1
день 2		респ. 2
день 3		респ. 3
день 4		реп. 4	респ. 1
день 5			респ. 2	респ. 1
день 6			респ. 3	респ. 2
день 7			реп. 4	респ. 3
день 8				реп. 4
день 9	Анализ видео данных и статистика (шаг 8)
респ и повторить

Таблица 2: Продолжительность обучения, время обучения и время тестирования для обучения, STM и LTM

	учение	STM	LTM
Время обучения	1 ч.	1 ч.	8 ч.
Время отдыха	0 ч.	1 ч.	24 ч.
начать обучение	0 ч. АЛО	0 ч. АЛО	4 ч. BLO
прекратить обучение	1 ч. АЛО	1 ч. АЛО	4 ч. АЛО
стартовый тест	1 ч. АЛО	2 ч. АЛО	0 ч. АЛО (на следующий день)
ALO - после того, как свет включается, BLO - перед включенным светом, STM - краткосрочная память, LTM - долгосрочная память

Таблица 3: Статистические данные, полученные по сценарию Analearn.
Статистические данные, полученные по сценарию analearn. Выходной файл загрузки R-скрипта, содержащего генотип, состояние обучения(т.е.обучение, STM, или LTM), означает CI наивный, средний CI обученный, LI, разница между LI управления по сравнению с экспериментальным состоянием (LI dif), нижний предел (LL) и верхний предел (UL) 95% интервал доверия LI dif, и p-значение,указывающее на вероятность того, что нет существенной разницы.

генотип	учение	Ке	Ке	Литий	Литий	нижний предел	верхний предел	p-значение
	состояние	наивный	обученный		разница	(95% интервал conficence)	(95% интервал conficence)
контроль	STM	0.467	0.116	0.752	NA	NA	NA	NA
Дап-а-РНК	STM	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
контроль	LTM	0.59	0.384	0.348	NA	NA	NA	NA
Дап-а-РНК	LTM	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

Дополнительный файл S1: План строительства палаты ухаживания. Файл может быть открыт с любым приложением, которое позволяет расширения .stp (CAD-файлы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл S2: Пример входного файла для сценария Analearn. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл S3: Сценарий Analearn.R. Файл может быть открыт с помощью R-студии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-