Drosophila Acondicionamiento del cortejo: un método para probar el aprendizaje y la memoria en las moscas

Overview

Este video describe un ensayo de acondicionamiento clásico que prueba el aprendizaje y la memoria en Drosophila,llamado acondicionamiento de cortejo. El ensayo se basa en la reducción del noviazgo masculino después de experimentar un rechazo por parte de una hembra premated no receptiva. El protocolo de ejemplo muestra una configuración para el procedimiento que se puede utilizar para evaluar la memoria a corto y largo plazo.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

NOTA: En el protocolo que se describe a continuación, se describe una réplica de la recopilación, capacitación y pruebas. Para probar la reproducibilidad de los resultados, estos pasos deben repetirse en paralelo, en varios días y con grupos separados de moscas (Tabla 1). El protocolo se basa en un ciclo de vida de 10 días de huevo a adulto, que es normal al criar moscas en condiciones constantes de 25 °C, 70% de humedad y un ciclo de 12 h de luz/oscuridad. Todos los aspectos de este protocolo suponen que las condiciones se mantienen constantes durante todo el ensayo. Los tiempos se indican como horas antes de que las luces se enciendan (BLO) o después de que las luces se enciendan (ALO) en la incubadora, ya que esto se puede ajustar convenientemente dependiendo de la hora preferida del día del investigador. Utilice el gas CO₂ sólo para la colección inicial de moscas macho ingenuas y para la colección de hembras premated. Este protocolo para el acondicionamiento del cortejo se compone de los siguientes pasos:

1. Establecimiento de culturas de colección femeninas premamadas
2. Establecimiento de culturas para la colección de sujetos de prueba masculinos
3. Preparación de bloques de viviendas
4. Establecimiento de viales de apareamiento para la producción de hembras prematizadas estandarizadas
5. Colección de sujetos de prueba masculinos
6. adiestramiento
7. ensayo
8. Análisis y estadísticas de datos de vídeo

1. Establecimiento de culturas de colección femenina premamada

1. Preparar alimentos para el consumo de energía. Hierva 0,8% (w/v) de agar, 8% (w/v) levadura, 2% (w/v) extracto de levadura, 2% (w/v) peptona, 3% (w/v) sacarosa, 6% (w/v) glucosa, 0.05% (w/v) MgSO_4,y 0.05% (w/v) CaCl₂ en agua durante 15 minutos. Deje que la solución se enfríe a 70 °C antes de añadir 0.05% (w/v) metilparabeno(PRECAUCIÓN: tóxico)y 0.5% (v/v) ácido propionico(PRECAUCIÓN: tóxico). Mezcle bien revolviendo mientras se enfría aún más a 50 °C para obtener una solución homogénea.
2. Antes de que el alimento se solidifique a temperatura ambiente, agregue ~50 ml de alimentos de potencia a cada vial de plástico de 175 ml. Deje que la comida se enfríe aún más. Cierre el vial con un enchufe.
   NOTA: Powerfood es una mezcla alimentaria especializada formulada específicamente para la producción de un gran número de moscas, presumiblemente induciendo la puesta de huevos. Powerfood no se utiliza para producir moscas macho que se utilizarán para el análisis de comportamiento (paso 2) porque la dieta atípica y el hacinamiento potencial podrían influir en el desarrollo.
3. El día -11(Tabla 1),iniciar 5-20 cultivos de wildtype con aproximadamente 60-100 moscas (una mezcla de machos y hembras) en viales de alimentos alimenticios; estos se utilizarán en el paso 4 para producir hembras prematizadas estandarizadas. Añadir un papel de filtro a cada vial para aumentar el área sobre la que las larvas pueden pupar; esto aumentará el número de moscas que pueden eclosionar.
4. Repita periódicamente los pasos 1.1-1.3 a lo largo del experimento para obtener suficientes moscas recién eclosiantes como insumo para el "establecimiento de viales de acoplamiento para la producción de hembras prematizadas estandarizadas" (paso 4).

2. Establecimiento de culturas para la colección de sujetos de prueba masculinos

1. Preparar alimentos normales, hechos con agar del 0,5% (v), 2.75% (w/v) levadura, 5.2% (w/v) harina de maíz, 11% (w/v) azúcar, 0.05% (w/v) metilparabeno, y 0.5% (v/v) ácido propionico en agua, como se describe en los pasos 1.1 y 1.2. Cierre los viales de plástico de 175 ml con un tapón de vial de mosca.
2. El día -10(Tabla 1),coloque alrededor de 10-20 machos con aproximadamente 30-75 hembras vírgenes(Tabla de Materiales/Equipos)en cada vial de 175 ml que contenga alimentos normales. Agregue un papel de filtro para aumentar el área de la superficie para la pupación y maximizar la productividad.
3. Establecer de tres a seis viales de 175 ml por genotipo para obtener el número requerido de machos sujetos de prueba.
   NOTA: Es posible que se necesiten más viales, dependiendo de la productividad del genotipo deseado.

3. Preparación de bloques de viviendas (Figura 2A)

1. Derretir aproximadamente 50 ml de alimentos alimenticios por bloque de carcasa en un microondas, o prepararlo fresco.
2. Añadir 500 μL de alimentos de potencia a cada pozo de un bloque de 96 pozos, de fondo plano utilizando una pipeta multidispensar.
3. Deje que los alimentos se solidifiquen a temperatura ambiente.
4. Cubra los bloques con película adhesiva PCR y utilice una aguja para hacer al menos 4 agujeros por pozo para proporcionar aire fresco a las moscas.
5. Para poder abrir cada pozo, utilice una cuchilla de afeitar para cortar la película adhesiva a lo largo de cada fila. Deje la película intacta en un extremo del bloque.
6. Los bloques se pueden almacenar a 4 °C durante un tiempo de hasta 2 días.
   NOTA: Permita que los bloques se reequilibren a temperatura ambiente antes de su uso.

4. Establecimiento de viales de apareamiento para la producción de hembras prematizadas estandarizadas

1. El día -1, retire y deseche todas las moscas de wildtype adultas de los cultivos de colección femenina premated a 2-5 h BLO.
2. Recoge moscas con el aspirador(Figura 2B)de estos viales en intervalos de 2 a 3 h(por ejemplo, a 30 min, 2,5 h y 5 h ALO) y colócalos en un nuevo vial de powerfood complementado con una pequeña cantidad de pasta de levadura y papel filtrante.
3. Para evitar el hacinamiento y promover una atmósfera óptima de apareamiento, no transfiera más de 150-200 moscas a cada vial nuevo. Asegurar el apareamiento de todas las hembras proporcionando al menos un 25% de machos. Asegúrese de que haya suficientes hembras presentes en los viales de acoplamiento para adaptarse al tamaño del experimento.
   NOTA: Como este es un paso crucial en el protocolo, asegúrese de que sólo las moscas recién eclosed y no viejas moscas, larvas o pupas se transfieren al nuevo vial de apareamiento.
4. Incuba estos "viales de apareamiento" durante cuatro días para dar tiempo suficiente para que todas las hembras se hayan apareado.

5. Colección de sujetos de prueba masculinos

1. El día 1(Tabla 1)a 2-3 h BLO, utilice CO₂ para eliminar todas las moscas adultas de los viales de recolección masculina (paso 2), pero deje que más moscas eclosa en las próximas horas.
2. Durante las siguientes 5-6 h, retire las moscas recién eclosed cada 20-30 minutos usando CO₂ y ponga a cada macho en un pozo individual del bloque de la vivienda (paso 3) usando el aspirador(Figura 2B).
3. Vuelva a sellar el pozo con la película PCR adhesiva.
   NOTA: Este es un paso crucial en el protocolo. Los machos deben recogerse con frecuencia. Los machos recogidos deben estar aislados en el bloque de viviendas cerca del momento de la eclosión, cuando demuestren pigmentación pálida y la presencia del meconio en el abdomen translúcido.
   NOTA: El uso suave del aspirador permite la transferencia de moscas; sin embargo, el uso inapropiado hará hincapié en las moscas, causando varianza en el ensayo (ver la discusión).
4. Aspira a recoger hasta 48 machos por genotipo. Esto proporciona un pequeño exceso al número máximo de machos necesarios para el análisis de condiciones ingenuas y entrenadas, lo que permite cierta pérdida durante los pasos de transferencia posteriores.

6. Formación

1. Retire las moscas del vial de apareamiento (paso 4.2) usando CO₂ y separe a las hembras prematadas de los machos.
2. Usando el aspirador, agregue una sola hembra anestesiada y prematizada a cada pozo en una fila de un nuevo bloque de viviendas.
3. Utilizando el aspirador y sin anestesia, transfiera a un varón ingenuo individual desde el bloque de viviendas instalado en el paso 5.2 hasta el pozo que contiene una hembra premamada. Después de colocar al macho en el pozo, vuelva a sellar inmediatamente con la película adhesiva; no permita que el macho escape.
   NOTA: Transfiera moscas macho desde el aspirador al bloque de viviendas aprovechando su comportamiento natural de "geotaxis negativa".
4. Repita los pasos 6.2-6.3 hasta que se establezcan suficientes parejas macho-hembra. Idealmente, establecer 24 pares, dos filas completas de un bloque de viviendas, por genotipo. Deje a los machos ingenuos restantes en el bloque de viviendas original instalado en el paso 5.2.
5. Deje a las parejas hombre-mujer sin perturbar durante el período de entrenamiento(Tabla 2, Figura 1B).
   NOTA: Durante este tiempo, el macho cortejará y será rechazado por la hembra premamada. Para el aprendizaje y la STM, el período de entrenamiento es de 1 h y para LTM, el período de entrenamiento es de 7-9 h.
6. Finalizar el entrenamiento (Tabla 2, Figura 1B) mediante el uso de un aspirador para separar suavemente al macho de la hembra premated; no utilice anestesia. Coloque al macho separado en un nuevo bloque de viviendas.
7. Utilice el aspirador para transferir a todos los machos ingenuos suavemente y sin anestesia desde el bloque de viviendas instalado en el paso 5.2 a un nuevo bloque de viviendas.
   NOTA: Este paso es opcional para STM y aprendizaje, pero es muy importante para LTM porque las moscas están alojadas por 24 h adicionales para probar LTM.
8. Para STM y LTM, permita que los machos descansen durante 1 h y ~24 h, respectivamente (Tabla 2, Figura 1B) antes de la prueba (paso 7).
9. Para el aprendizaje, pruebe inmediatamente a los machos entrenados e ingenuos (paso 7).

7. Pruebas

1. Recoger moscas de viales de apareamiento (paso 4.2) usando CO₂ y separar las hembras prematadas de los machos.
2. Deje que las hembras se recuperen de la anestesia durante al menos 1 h en un vial que contenga alimentos normales.
3. Monte las grabadoras de vídeo de antemano(Figura 2C),con el fin de tener todo el equipo listo antes de que comiencen las pruebas.
4. Inicie las pruebas de acuerdo con las diferentes escalas de tiempo para el aprendizaje, STM y LTM (Tabla 2, Figura 1B). Realizar pruebas inmediatamente después del entrenamiento para el aprendizaje, 1 h después del entrenamiento para STM, y 24 h después del entrenamiento para LTM.
5. Utilizando el aspirador, transfiera suavemente a un varón individual desde el bloque de viviendas en reposo o desde el bloque de viviendas de entrenamiento si se está probando el aprendizaje (paso 6.7, entrenado; paso 6.8, ingenuo) a la mitad de una arena de cortejo con el divisor cerrado(Figura 2D; ver Archivo S1 para un plan de construcción).
   NOTA: El uso del comportamiento natural de "geotaxis negativa" debe ser suficiente para transferir las moscas macho del aspirador a la arena de cortejo.
6. Mueva rápida pero suavemente el hoyo de entrada a la siguiente arena y repita el paso 7.5 hasta que las 18 arenas contengan un macho.
7. Usando el aspirador y sin CO_2,añade una hembra premated (recogida en el paso 7.2) a la otra mitad de los 18 estadios.
8. Coloque cuidadosamente la cámara de cortejo debajo de la cámara, con la apertura de los pozos mirando hacia abajo(Figura 2C).
9. Retire el divisor de las arenas para permitir la interacción directa entre los machos y las hembras prematadas.
10. Comience inmediatamente a registrar el comportamiento durante al menos 10 minutos.
    NOTA: Cuando se utiliza una configuración de dos cámaras, la grabación paralela de dos placas de cortejo se puede hacer en plazos superpuestos para maximizar la eficiencia.
11. Vacíe las arenas de cortejo usando una aspiradora manual y permita que la cámara de cortejo se ventila antes de su reutilización.
12. Repita el paso 7.4-7.11 hasta que se hayan completado las pruebas de todos los genotipos y condiciones(es decir, ingenuos y entrenados).

8. Análisis y estadísticas de datos de vídeo

1. Calcular el índice de cortejo (CI), definido como el porcentaje de tiempo que los tribunales masculinos durante los primeros 10 minutos del período de prueba, para cada mosca masculina individual.
   NOTA: Esto se puede hacer manualmente observando el comportamiento del cortejo estereotipado (Figura 1A) o mediante el uso de software informático para la cuantificación automatizada del comportamiento del cortejo.
   NOTA: Se recomienda analizar 40-60 machos por condición en el transcurso de tres días con el fin de lograr suficiente poder estadístico y juzgar la consistencia de los datos de CI.
2. Calcular el índice de aprendizaje (LI), definido como la reducción porcentual en el CI medio de los machos entrenados en comparación con los machos ingenuos (LI = (IC_ingenuo – CI_entrenado) / CI_ingenuo). Evalúe el LI para cada día de prueba y compárela con el LI acumulativo calculado a partir de todos los días de prueba combinados.
3. Haga un archivo de datos de tabulación de dos columnas independiente con "Genotype" y "CI" como encabezados.
   NOTA: Estos encabezados distinguen entre mayúsculas y minúsculas. El nombre del genotipo para cada CI debe consistir en una descripción del genotipo seguida de un subrayado y la condición de entrenamiento(por ejemplo, genotype_N y genotype_LTM, etc., donde N = ingenuo y LTM = memoria a largo plazo; ver Archivo suplementario S2 por ejemplo). Esta anotación es esencial, ya que la función analearn identificará moscas entrenadas e ingenuas basadas en los caracteres presentes después del primer subrayado en la columna "Genotype".
4. Utilice el script analearn R (Archivo suplementario S3) para realizar una prueba de aleatorización para juzgar la importancia estadística de las diferencias entre los valores LI de diferentes genotipos.
   1. Origen del script (Archivo suplementario S3) en R, que define una función llamada "analearn."
      NOTA: La definición de función es: analearn <- función(nboot = 10.000, naivelevel = 'N', refmutación = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Inicie la función introduciendo "analearn()" en la línea de comandos R y seleccionando el archivo de datos que se va a analizar (producido en el paso 8.3) a través de la ventana emergente.
   3. Elija la mutación de referencia, que es el genotipo de control, introduciendo el número correspondiente y presionando enter.
      NOTA: Después de seleccionar el genotipo de referencia, el script tarda varios segundos en realizar 10.000 réplicas de arranque.
   4. Observe la tabla de salida (Tabla 3), que contiene el genotipo, la condición de aprendizaje(es decir,aprendizaje, STM o LTM), significa CI ingenuo, CI entrenado en CI, LI, la diferencia entre el LI del control en comparación con la condición experimental (LI dif), el límite inferior (LL) y el límite superior (UL) del intervalo de confianza del 95% del LI dif, y el valor pque indica la probabilidad de que no haya ninguna diferencia significativa.
      NOTA: analearn almacenará un archivo de texto de salida en el directorio donde se encuentra el archivo de datos. Sin embargo, la tabla de salida también aparece en la consola de R-Studio. El nombre predeterminado se construye en función del nombre del archivo de datos proporcionado.
   5. Hay varios argumentos en la función analearn que se pueden utilizar para modificar la configuración predeterminada de la función para ajustar los parámetros del arranque.
      NOTA: "nboot" define el número de réplicas de arranque y se establece en 10.000 de forma predeterminada. Este valor se puede cambiar a cualquier número entero mayor que cero. La Tabla 5 alista varios argumentos que se pueden utilizar para modificar la configuración predeterminada de la función. Sin embargo, no se recomienda utilizar datos que se producen con un número bajo de réplicas de arranque.

Representative Results

Figura 1: Determinación del Índice de Cortejo y Visión General Experimental. (A) Imágenes que muestran el comportamiento estereotipado del noviazgo masculino hacia una mosca femenina. Se muestran diferentes etapas del comportamiento del cortejo: orientación (I), continuación (II), vibración del ala (extensión) y roscado (III), lamer (IV) e intento de cópula (V). B) Resumen esquemático de los tiempos de entrenamiento y pruebas en relación con el ciclo de luz de la incubadora, marcado en horas. Los tiempos de entrenamiento se indican con barras, los períodos de descanso para STM y LTM se indican con una línea discontinua, y el punto de inicio de la prueba se indica como una flecha. Tenga en cuenta que el tiempo de prueba para LTM es el día después del entrenamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Equipo utilizado para el ensayo de acondicionamiento de cortejo Drosophila. (A) El bloque de la carcasa es un bloque plano, inferior con 500 μL de alimentos alimenticios por pozo. Está sellado con una película adhesiva qPCR con al menos 4 agujeros por pozo que fueron creados con una aguja de jeringa con un diámetro de 0,8 mm. Las filas individuales se cortan a lo largo de las tiras utilizando una cuchilla de afeitar para permitir la apertura y el cierre. (B) El aspirador es necesario para la transferencia suave de moscas machos y hembras sin el uso de anestesia. El inserto muestra la punta del aspirador, cerrado con un pedazo de algodón para mantener las moscas dentro de la punta. (C) Configuración de un sistema de dos cámaras para la grabación simultánea de dos salas de cortejo. DUna sala de cortejo con 18 estadios. Los orificios de entrada deslizantes se utilizan para colocar las moscas en las arenas. Los divisores blancos se pueden abrir simultáneamente para iniciar la interacción entre los machos y las hembras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Ejemplo de escala de tiempo para probar LTM a lo largo de tres réplicas en días individuales.

	General	recoger	tren	prueba
día -11	Iniciar cultivos de colección femenina premamatizados (paso 1.3)
día -10	Iniciar cultivos para la colección de sujetos de prueba masculinos (paso 2.2)
día 1		representante 1
día 2		representante 2
día 3		representante 3
día 4		representante 4	representante 1
día 5			representante 2	representante 1
día 6			representante 3	representante 2
día 7			representante 4	representante 3
día 8				representante 4
día 9	Análisis y estadísticas de datos de vídeo (paso 8)
rep = repetir

Tabla 2: Duración del entrenamiento, tiempos de entrenamiento y tiempos de prueba para el aprendizaje, STM y LTM

	aprendizaje	Stm	LTM
Tiempo de entrenamiento	1 h.	1 h.	8 h.
Tiempo de descanso	0 h.	1 h.	~ 24 h.
comenzar la formación	0 h. ALO	0 h. ALO	4 h. BLO
dejar de entrenar	1 h. ALO	1 h. ALO	4 h. ALO
prueba de inicio	1 h. ALO	2 h ALO	0 h. ALO (al día siguiente)
ALO = después de encender las luces, BLO = antes de que las luces se enciendan, STM = memoria a corto plazo, LTM = memoria a largo plazo

Tabla 3: Datos estadísticos producidos a partir del guión de Analearn.
Datos estadísticos producidos a partir del guión de analearn. El archivo de salida del script R de arranque que contiene el genotipo, la condición de aprendizaje(es decir,aprendizaje, STM o LTM), significa IC ingenuo, CI entrenado en CI, LI, diferencia entre LI del control en comparación con la condición experimental (LI dif), el límite inferior (LL) y el límite superior (UL) del intervalo de confianza del 95% de LI dif, y el valor pque indica la probabilidad de que no haya ninguna diferencia significativa.

genotipo	aprendizaje	Ci	Ci	Li	Li	Límite inferior	Límite superior	valor p
	condición	ingenuo	entrenado		diferencia	(Intervalo de conficencia del 95%))	(Intervalo de conficencia del 95%))
control	Stm	0.467	0.116	0.752	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi	Stm	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
control	LTM	0.59	0.384	0.348	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi	LTM	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

Expediente Suplementario S1: Plan de construcción de una sala de cortejo. El archivo se puede abrir con cualquier aplicación que permita extensiones .stp (archivos CAD). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario S2: Ejemplo de un archivo de entrada para el script de Analearn. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario S3: El script Analearn.R. El archivo se puede abrir con R-studio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-