Summary
المكوكات الجزيئية التي تتكون من ميكروتثبول functionalized التزلق على سطح التزمت خدمة يمكن kinesin البروتينات السيارات كنظام النقل النانو. هنا ، هو وصف لنظام تجميع المكوك نموذجي.
Abstract
وقد تطورت الخلايا الجزيئية ، آلات متطورة ، مثل البروتينات والخيوط السيارات kinesin أنيبيب ، لدعم النقل بين الخلايا النشطة من البضائع. في حين يربط kinesins ذيل المجال لمجموعة متنوعة من البضائع ، رئيس kinesins المجالات الاستفادة من الطاقة الكيميائية المخزونة في جزيئات ATP لخطوة على أنيبيب شعرية. منذ فترة طويلة ، شديدة ميكروتثبول بمثابة مسارات للنقل لمسافات طويلة داخل الخلايا.
ويمكن أيضا هذه المحركات وشعيرات أن تستخدم في البيئات الاصطناعية microfabricated كعناصر في المكوكات الجزيئية 1. في تصميم تستخدم بشكل متكرر ، وترسو kinesin المحركات على السطح من خلال المسار ذيولها ، وميكروتثبول functionalized بمثابة شحن تحمل العناصر التي تدفعها هذه المحركات. ويمكن تحميل هذه المكوكات مع البضائع من خلال الاستفادة من الربط بين القوي وانتقائية والبيوتين streptavidin. المكونات الرئيسية (تويولين biotinylated ، streptavidin ، والبضائع biotinylated) متاحة تجاريا.
بناء على تجربة حركية مقلوب الكلاسيكية 2 ، هو مفصل في بناء المكوكات الجزيئية هنا. وكثف Kinesin البروتينات السيارات على سطح precoated مع الكازين ، ويتم بلمرة ميكروتثبول من تويولين biotinylated ، انضمت إلى kinesin والمغلفة في وقت لاحق مع streptavidin - رودامين المسمى. المحافظة على التركيز في بطولة تركيز subsaturating لتحقيق سرعة مزلق أنيبيب الأمثل لتحميل البضائع 3. أخيرا ، تضاف biotinylated فلوريسئين المسمى nanospheres والبضائع. Nanospheres نعلق على ميكروتثبول نتيجة اصطدام بين ميكروتثبول مزلق وnanospheres الانضمام إلى السطح.
ويمكن بسهولة تعديل البروتوكول لتحميل مجموعة متنوعة من البضائع مثل الحمض النووي biotinylated 4 ، 5 نقاط الكم أو طائفة واسعة من مضادات الأجسام المضادة عبر biotinylated 4-6.
Protocol
1). المخازن والكواشف
وينبغي إعداد هذه الحلول في وقت مبكر وتخزينها في aliquots الحجم مريح. يجب على قسامة تحتوي حلا كافيا لإجراء تجربة نموذجية وقسامة جديدة يجب أن تستخدم لفحص كل حركية. وأشار أيضا إلى ظروف التخزين والأحجام قسامة نموذجية في البروتوكولات التالية.
1. BRB80 العازلة ، (مواسير 80 ملم ، 1 ملم MgCl 2 ، 1 ملم المقطر منزوع الأيونات في EGTA (د) من الماء ، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 6.9 كوه)
- تشكل الأسهم 100 مل حل EGTA M 0.5 في الماء د. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم 2 م.
- تشكل الأسهم 100 مل حل MgCl M 1 2 في الماء د. الأوتوكلاف الحل.
- إضافة 24.2 غرام من أنابيب و 3.1 غ من الكريات KOH في حوالي 800 مليلتر من الماء ويحرك د حل. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.9 باستخدام 1 حل KOH M. إضافة 2 مل من محلول المخزون 0.5 متر وEGTA 1 مل من محلول 1 MgCl M الأسهم 2. إظهار حجم إلى 1000 مليلتر من الماء د.
- قسامة إلى 50 مل أنابيب الصقر وتجميد -20 درجة مئوية في لاستخدامها في المستقبل. ويمكن تخزين أنبوب BRB80 المستخدمة حاليا في 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة.
2. كلوريد المغنيسيوم ، MgCl 2 (100 مم في الماء د)
- المخفف في الماء د لتحقيق تركيز النهائي من 100 ملم.
- قسامة (10 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل
3. غوانوزين - 5' - ثلاثي الفوسفات ، ملح الصوديوم ، GTP (25 ملم في المياه د ، ودرجة الحموضة تعديلها ل7 من هيدروكسيد الصوديوم)
- تزن بها وتذوب في الماء د وضبط درجة الحموضة إلى 7 محلول هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 2 م.
- التحقق من تركيز الأشعة فوق البنفسجية من خلال قياس الامتصاصية في 260 نانومتر. (استخدام معامل الانقراض 11.7 × 103 سم -1 م -1).
- قسامة (10 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
4. ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، DMSO
- قسامة (10 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
5. التاكسول (1 ملم في DMSO)
- تزن بها وتذوب في DMSO تحت غطاء الدخان لتحقيق تركيز النهائي من 1 ملم.
- قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
6. D - (+) ، الجلوكوز ، (2 م في الماء د)
- تزن بها وتذوب في الماء د لتحقيق تركيز النهائي من 2 م.
- قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
7. أوكسيديز الجلوكوز ، (2 ملغ / مل في BRB80)
- تذوب في BRB80 لتحقيق تركيز النهائي من 2 ملغ / مل.
- قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
8. Dithiothreitol ، DTT (1 م في الماء د)
- تذوب في الماء د الدخان تحت غطاء محرك السيارة لتحقيق تركيز النهائي من 1 م.
- قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
9. الكاتلاز ، (0.8 ملغ / مل في BRB80)
- تذوب في BRB80 لا يقل عن 2 في مراحل لتحقيق تركيز النهائي من 0.8 ملغ / مل. تحديد تركيز في كل مرحلة من خلال قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 276 نانومتر و 406 نانومتر (استخدام معامل الانقراض من 3.1 × 10 5 سم -1 م -1 عند 276 نانومتر و 2.2 × 10 5 م -1 -1 سم إلى 406 نانومتر ، و المعادلة A CL =).
- قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
10. الأدينوزين ثلاثي الفوسفات ، 5' - ، ATP (100 ملم في MgCl 100mM 2)
- يعد حل سهم MgCl 100 مم 2 في الماء د. تزن من مسحوق جاف ، وتذوب في حل هذه الأسهم لتحقيق التركيز النهائي لل100mM.
- التحقق من تركيز الأشعة فوق البنفسجية من خلال قياس الامتصاصية في 260 نانومتر. (استخدام معامل انقراض 15،4 × 10 سم 3 -1 م -1).
- قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
11. الكازين الحل (20 ملغ / مل في BRB80 الكازين)
- إضافة ما يقرب من 3 إلى 30 الكازين ز د مل ماء في أنبوب 50 مل الصقر. الدوامة لحوالي 1 ساعة حتى حل تطور الاتساق سميكة.
- أجهزة الطرد المركزي في حوالي 15000 ز لمدة 30 دقيقة. تصفية طاف خلال 0.5 و 0.2 ميكرومتر مرشحات حقنة ميكرون.
- تحديد تركيز طاف من خلال قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر (استخدام معامل انقراض 0.67 مل الطول -1 ملغ -1). تمييع ل20 ملغ / مل في BRB80.
- قسامة (20 حجم ميكرولتر) فيإلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
2) حلول قياسي
وتعد هذه في يوم من التجربة ، وينبغي التخلص منها بعد هذه التجربة قد انتهت. إعداد 1 مل من كل منهما.
1. BRB80CS0.5
- الكازين تمييع الحل في BRB80 إلى تركيز النهائي من 0.5 ملغ / مل وتخزينها على الجليد. يتم تقديم هذا الحل في الخلية قبل تدفق kinesin ويساعد على الاحتفاظ النشاط kinesin بعد الامتزاز السطح.
2. BRB80CA
- تعد 0،2 ملغ / مل الكازين و 1 ملم في بطولة BRB80 وتخزينها على الجليد. غير المخفف مزيد Kinesin باستخدام هذا الحل قبل إدخالها في الخلية التدفق.
3. BRB80T
- تمييع الحل التاكسول في BRB80 إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ويستخدم هذا الحل لتحقيق الاستقرار في ميكروتثبول.
4. BRB80CT
- إعداد 10 ميكرومتر التاكسول و 0.2 ملغ / مل الكازين في BRB80 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ويستخدم هذا لإعداد المزيد من antifade أنيبيب والحلول.
5. BRB80AF
- إعداد 20 ملي D - غلوكوز ، 20 أوكسيديز الجلوكوز ميكروغرام / مل ، و 8 ميكروغرام / مل الكاتلاز ، 10 DTT ملم ، و 20 ميكرومتر في بطولة BRB80CT وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ويستخدم هذا الحل لتخفيف streptavidin وnanospheres و "غسل الى" streptavidin الزائدة في الخلية التدفق. يمكن التحكم في سرعة kinesin عن طريق ضبط تركيز ATP في هذا الحل.
3) إعداد Kinesin
- التعبير عن kinesin بناء يتألف من النمط البري ، وسلسلة ذبابة الفاكهة كامل طول kinesin melanogaster الثقيلة وصاحب محطة C - - العلامة في القولونية وتنقية باستخدام عمود ني NTA كما هو موضح في 6.
- جعل aliquots (10 ميكرولتر لكل منهما) في 0.5 مل من الأنابيب وتخزين microcentrifuge في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. تركيز kinesin النشطة في هذه aliquots ما يقرب من 200 نانومتر. 7
- عن تجربة نموذجية ، تمييع الحل kinesin 20 أضعاف في BRB80CA. تسمية KIN20 حل وتخزين أكثر من الثلج.
4) إعداد أنيبيب
- في أنبوب مل microcentrifuge 0.5 ، إعداد 25 ميكرولتر من محلول النمو : 4 مم MgCl 2 ، 1 ملم وGTP DMSO 5 ٪ (V / V) في BRB80 العازلة.
- إضافة 6.25 ميكرولتر من حل لهذه قسامة ميكروغرام 20 من تويولين biotinylated مجفف بالتجميد.
- الدوامة ، ثم ضع في حمام الحرارة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتبلمر. تمييع 100 أضعاف في دوامة BRB80T وبلطف. تسمية MT100 الحل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- جعل التخفيف من 10 أضعاف في MT100 BRB80AF. تسمية MT1000 الحل.
5) وStreptavidin Nanosphere الحل
إعداد AlexaFluor568 المسمى streptavidin بتركيز 100 نانومتر في BRB80AF. تسميته STV100 وتخزينها على الجليد. وبالمثل ، تمييع nanospheres 5000 أضعاف في حل BRB80AF. تسميته NS5000 وتخزينها على الجليد.
6) البناء تدفق الخلية
بناء flowcell coverslips باستخدام الزجاج اثنين مفصولة الوجهين الشريط. هذه الخلية تدفق ما يقرب من 2 سم ، 1 سم وارتفاعها 100 ميكرون ، ويبلغ حجمه حوالي 20 ميكرولتر. يتم تقديم الحلول في الخلية التدفق من جانب واحد باستخدام ماصة الاشرار والخروج من جهة أخرى على استعمال ورق الترشيح.
7) الجمعية الفحص مقلوب
وهي مغلفة first سطح الزجاج مع الكازين الذي يسمح kinesin للاحتفاظ به وظائف على الامتزاز. بعد كثف kinesin ، يتم عرض ميكروتثبول ، التي تعقد من قبل kinesin. والمغلفة ثم ميكروتثبول مع streptavidin الفلورسنت. بعد الغسيل خارج streptavidin الزائدة ، ويتم تقديمها biotinylated البوليسترين فلوريسئين nanospheres (40 قطرها نانومتر). nanospheres سطح ثابت كثف تتصادم مع ميكروتثبول الانتقال والحصول على تحميلها لهم (الشكل 1).
يتم سرد ترتيب تدفق الحلول والوقت المسموح به قبل تطبيق الحل التالي أدناه.
- BRB80CS0.5 ، 5 دقائق
- KIN20 ، 5 دقائق
- MT1000 ، 5 دقائق
- STV100 ، 5 دقائق
- BRB80AF ، 3X
- NS5000
8) الميكروسكوب
تركيب الخلية تدفق على المسرح المجهر على الفور بعد إدخال nanosphere. في هذه التجربة ، وهو الكسوف مضان المجهر TE2000 - U (نيكون ، ميلفيل ، نيويورك) مجهزة هدفا النفط 100X (NA 1.45) ، وهو يستشهد X - 120 مصباح (EXFO ، اونتاريو ، كندا) وEMCCD iXon الكاميرا (ANDOR ، واستخدمت جنوب وندسور ، ط م). واستخدمت عامل تصفية FITC مكعب (# 48001) ، وتصفية TRITC مكعب (# 48002 ، كروما تكنولوجيز ، روكينجهام ، VT) لnanospheres الصورة وrespecti ميكروتثبولvely على السطح السفلي من خلايا التدفق. كانت المرة التعرض 0.2s ، في حين أن الوقت كان 2 بين التعرض ثانية.
الشكل 1. الرسم التخطيطي للالمكوكات الجزيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع تعديلات طفيفة ، وقد تم هذا البروتوكول يستخدم بنجاح من قبل مجموعة متنوعة من الجماعات لتجميع kinesin - أنيبيب المقايسات الحركية القائمة. ويمكن استبدال 10 ملم في DTT الحل النهائي مع حركية 0.5 ٪ β - المركابتويثانول. وينبغي أن الحلول القياسية (BRB80AF ، وKIN20 MT1000) أكثر من 2 ساعة قديمة لم تستخدم. لا ينبغي أبدا أي محلول يحتوي على ميكروتثبول التاكسول وخاصة توضع على الجليد. التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية لخلية تدفق ضوء النتائج الإثارة في photodamage لعناصر وظيفية : 8 kinesin ميكروتثبول وهذا التأثير أكثر وضوحا إذا كانت الخلية تحتوي على بوليمرات مع تدفق الأوكسجين الانتشارية عالية مثل البوليسترين nanospheres 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن مدينون بشدة لجوناثان هوارد ، الذي وضعت مجموعة بروتوكول الأساسية للمقايسة حركية مزلق التي تم تكييفها لاحقا من قبلنا. مع التقدير والإمتنان الدعم المالي من جبهة الخلاص الوطني منحة DMR0645023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | |
| Biotin tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | |
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Group | 106399 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
References
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).
- Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles. Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).
- Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins. Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).
- Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins. Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).
- Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes. J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).
- Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes. Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).
- Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).
- Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).
