Summary
に滑走の官能微小管から成る分子シャトルの表面に付着キネシンモータータンパク質は、ナノスケールの交通システムとして機能することができます。ここで、典型的なシャトルのシステムのアセンブリが記述されています。
Abstract
細胞は、貨物のアクティブな細胞内輸送をサポートするために、そのようなキネシンモーター蛋白質と微小管のフィラメントとして、洗練された分子機構を進化させてきた。キネシンのテールドメインは、貨物の多様に結合する一方、キネシン頭部ドメインは微小管の格子に沿って進むためにATP分子に保存されている化学エネルギーを利用する。長く、硬い微小管は、長距離細胞内輸送のためのトラックとして機能します。
これらのモータとフィラメントはまた、分子シャトル1の構成要素として、微細加工、合成環境で使用することができる。頻繁に使用する設計では、キネシンモーターはその尾を介して路面に固定されています、そして、官能微小管は、これらのモーターによって推進されている要素を、運ぶ貨物として役立つ。これらのシャトルは、ビオチンとストレプトアビジンとの間の強力かつ選択的結合を利用して貨物をロードすることができます。主要コンポーネントは、（ビオチン化チューブリン、ストレプトアビジン、およびビオチン化貨物）市販されている。
古典的な反転運動性アッセイ2で構築し、分子シャトルの建設は、ここで詳しく説明されています。キネシンモーター蛋白質はカゼインでプレコート表面に吸着され、微小管は、ビオチン化チューブリンから重合したキネシンに付着し、その後、ローダミン標識ストレプトアビジンでコーティングされています。 ATP濃度は、貨物3をロードするための最適な微小管の滑走速度を達成するためにsubsaturatingの濃度で維持されます。最後に、ビオチン化フルオレセイン標識ナノスフェアは、貨物として追加されます。ナノスフェアは、表面に付着したグライダーの微小管とナノ粒子間の衝突の結果として微小管に接続します。
プロトコルは、容易にこのようなビオチン化DNA 4、量子ドット5またはビオチン化抗体を4から6を介して抗原の多種多彩な貨物の様々なを読み込むように変更することができます。
Protocol
1）のバッファーと試薬
これらのソリューションは事前に準備し、便利なサイズのアリコートに格納する必要があります。アリコートは典型的な実験と新鮮なアリコートを各運動性アッセイのために使用されるための十分な解決策が含まれている必要があります。保存条件と典型的な分量のサイズは、以下のプロトコールに記載されています。
1。 BRB80バッファ、（80mMのPIPES、1mMのMgCl 2、脱イオン蒸留中の1mM EGTA（DD）水、KOHで6.9に調整したpH値）
- DDの水に0.5 M EGTAの100 mLの原液を作る。 2 M NaOH溶液を用いてpHを7.0に調整する。
- DDの水の1 M MgCl 2の100 mLの原液を作る。ソリューションをオートクレーブ。
- パイプとddの水の約800 mLの3.1グラムのKOHペレットの24.2 gを追加し、溶解するかき混ぜる。 1 M KOH溶液を用いて6.9にpHを調整する。 0.5 M EGTAのストック溶液と1 MのMgCl 2ストック溶液を1 mLの2 mlを加え。 DDの水で1000 mlにボリュームを起動します。
- 将来使用するまで-20℃で50mlのファルコンチューブとフリーズに分注し。現在使用されてBRB80チューブを4℃または室温で保存することができます。
2。塩化マグネシウム、 塩化マグネシウム（DDの水では100mM）
- 100mMの最終濃度を達成するためにDDの水で希釈する。
- 将来使用するまで-20℃で0.5 mLのマイクロ遠心チューブとストアへのアリコート（10μLボリューム）
3。グアノシン-5' - 三リン酸、二ナトリウム塩、GTP（NaOHで7に調整DD水、pHの25mMの）
- 秤量し、DDの水に溶解し、2 M NaOH溶液でpHを7に調整する。
- 260 nmでのUV吸光度を測定して濃度を確認します。 （11.7 × 103 M -1 cm -1の吸光係数を使用してください）。
- 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（10μLボリューム）。
4。ジメチルスルホキシド、DMSO
- 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（10μLボリューム）。
5。タキソール（DMSO中の1mM）
- 秤量および1mMの最終濃度を達成するためにヒュームフードの下にDMSOに溶解する。
- 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。
6。 D -（+） - グルコース、（DDの水で2 M）
- 秤量し、2 Mの最終濃度を達成するためにDDの水に溶解
- 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。
7。グルコースオキシダーゼ、（BRB80 2 mg / mLの）
- 濃度2μg/ mlの最終濃度を達成するためにBRB80に溶ける。
- 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。
8。ジチオスレイトール、DTT（DD水で1 M）
- 1 Mの最終濃度を達成するために換気フードの下のdd水に溶ける
- 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。
9。カタラーゼ、（BRB80 0.8 mg / mLの）
- 0.8 mg / mLの最終濃度を達成するために少なくとも2段階でBRB80に溶解する。 276 nmでのUV吸光度を測定し、各段階での濃度と406 nmの（406 nmで276 nmで3.1 × 10 5 M -1 cm -1のと2.2 × 10 5 M -1 cm -1の吸光係数を使用して決定する方程式= CL）。
- 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。
10。アデノシン5' -三リン酸、ATP（100mMのMgCl 2の 100 mM）を
- DDの水に100 mMのMgCl 2ストック溶液を準備します。乾燥粉末を秤量して100mmの最終濃度を達成するためにこのストック溶液に溶解する。
- 260 nmでのUV吸光度を測定して濃度を確認します。 （15.4 × 10 3 M -1 cm -1の吸光係数を使用してください）。
- 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。
11。カゼイン溶液（BRB80 20 mg / mLのカゼイン）
- 50mlファルコンチューブに30 mLのDDの水に約3 gのカゼインを追加。解決策が厚い一貫性を開発するまで約1時間ボルテックス。
- 30分間、約15000グラムで遠心。は0.5μmと0.2μmのシリンジフィルターを通して上清をフィルターします。
- 280 nmの（0.67 mLの投与-1 cm -1の吸光係数を使用）でのUV吸光度を測定することにより、上清の濃度を決定する。 BRB80 20 mg / mLのためにそれを希釈する。
- アリコート（20μLボリューム）の0.5mLの微量遠心チューブおよび将来使用するために-20℃で保存する。
2）標準ソリューション
これらは、実験当日に調製され、実験が終わった後に廃棄されるべきである。各1 mLを準備します。
1。 BRB80CS0.5
- BRB80で氷の上は0.5 mg / mLおよび店舗の最終濃度にカゼイン溶液を希釈する。この溶液は、キネシンのフローセルに導入し、表面吸着後のキネシンの活性を保持するのに役立ちますています。
2。 BRB80CA
- BRB80と氷の上の店では0.2 mg / mLのカゼインおよび1mM ATPを準備します。キネシンは、さらにフローセルに導入する前にこのソリューションを使用して希釈される。
3。 BRB80T
- BRB80で室温にて10μMと店舗の最終濃度にタキソール希薄溶液。このソリューションは、微小管を安定させるために使用されます。
4。 BRB80CT
- 室温でBRB80と店舗で10μMタキソールおよび0.2 mg / mLのカゼインを準備します。これは、さらに褪色防止と微小管の溶液を調製するために使用されます。
5。 BRB80AF
- 20 mMのD -グルコース、20μg/ mLのグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ8μg/ mLと、10mMのDTT、およびBRB80CTで20μMATPと室温でストアを準備します。このソリューションは、ストレプトアビジンとナノスフェアを希釈し、フローセル内に過剰なストレプトアビジンを"洗い流す"ために使用されます。キネシンの速度は、この溶液中のATP濃度を調整することによって制御することができます。
3）キネシンの準備
- キネシンを表現するには、大腸菌の野生型、フルレングスのキイロショウジョウバエのキネシン重鎖とC末端His -タグから成る建設し、6に記載のようにNi - NTAカラムを用いて精製する。
- -80 0.5mLの微量遠心チューブとストア内のアリコート（10μLずつ）を確認·今後の使用のためのC。これらのアリコートに積極的にキネシンの濃度は、約200nmである。7
- 典型的な実験では、キネシンのソリューションをBRB80CAで20倍に希釈する。氷の上のソリューションのKIN20とストアにラベルを付けます。
4）微小管の準備
- 0.5mLのマイクロ遠心チューブに、成長溶液25μLを準備：4mMの情報のMgCl 2、1mM GTP及び5％DMSO（v / v）をBRB80バッファに。
- 凍結乾燥ビオチン化チューブリンの20μgのアリコートに、このソリューションの6.25μLを加える。
- 37熱浴中の渦、その場所°重合するために30分間。優しくBRB80Tとボルテックスで100倍希釈する。室温でのソリューションのMT100とストアにラベルを付けます。
- BRB80AFのMT100の10倍希釈を行う。ソリューションMT1000にラベルを付けます。
5）ストレプトアビジンとナノ粒子のソリューション
BRB80AF 100 nMの濃度でAlexaFluor568標識ストレプトアビジンを準備します。氷の上にそれがSTV100と店舗ラベルを付けます。同様に、BRB80AFの溶液中でナノ粒子5000倍に希釈する。氷の上にNS5000およびストアにラベルを付けます。
6）フローセルの構造
両面テープで区切られた二つのガラス製カバースリップを使用して、フローセルを構築します。このフローセルは、1cm幅および100μmの高い、約2cmの長さで、約20μLの容積を持っています。ソリューションは、ろ紙を使用して、他からピペットと邪悪な外を使って片側からフローセルに導入されています。
7）逆アッセイのアセンブリ
ガラスの表面は、最初のキネシンが吸着時にその機能を保持できるようにするカゼインで被覆されている。キネシンが吸着された後、微小管はキネシンによって保持され、導入されています。微小管は、蛍光ストレプトアビジンでコーティングされています。過剰ストレプトアビジンを洗浄後、ビオチン化ポリスチレン蛍光ナノスフェア（40 nmの直径）が導入されています。表面吸着固定ナノスフェアは移動する微小管に衝突し、それらの（図1）にロードされる。
次のソリューションの導入前に許容されるソリューションと時間の流れの順序は、以下に記載されています。
- BRB80CS0.5、5分
- KIN20、5分
- MT1000、5分
- STV100、5分
- BRB80AF、3倍
- NS5000
8）顕微鏡
すぐにナノスフェアの導入後に顕微鏡のステージ上でフローセルをマウントします。この実験で、100倍油浸対物（NA 1.45）、X - Citeの120ランプ（EXFO、オンタリオ州、カナダ）およびIXON EMCCDカメラ（ANDOR、装備のEclipse TE2000 - U蛍光顕微鏡（ニコン、メルヴィル、ニューヨーク州）でサウスウィンザー、コネチカット州）を用いた。 FITCフィルターキューブ（＃48001）とTRITCフィルターキューブ（＃48002、クロマキー技術、ロッキンガム、バーモント州）は、画像のナノ粒子と微小管respectiするために使用されたvelyフローセルの底面。エクスポージャー間の時間は2秒だったしながら露光時間は、0.2秒だった
図1。分子シャトルの概略図。
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Discussion
マイナーな変更を加えることにより、このプロトコルが正常にキネシン微小管ベースの運動性アッセイを組み立てるためのグループの様々で使用されています。最終的な運動性の溶液中で10mMのDTT、0.5％β-メルカプトエタノールに置き換えることができます。 2時間以上古い標準溶液は（BRB80AF、KIN20とMT1000）に使用しないでください。特にタキソールと微小管を含む任意の溶液を氷の上に配置しないでください。機能部品の光損傷における紫外線励起光の結果にフローセルの過度のエクスポージャー：。微小管とキネシン8フローセルは、ポリスチレンのナノ粒子などの高酸素拡散性を有するポリマーが含まれている場合、この効果はさらに顕著である9。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、そのグループその後、当社が適応された滑走運動アッセイのための基本的なプロトコルを開発したジョナサンハワード、に重債務です。 NSFの助成DMR0645023からの財政支援を感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | |
| Biotin tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | |
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Group | 106399 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
References
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