Summary
표면 준수 kinesin 모터 단백질이 nanoscale 교통 시스템으로 제공할 수에 글라이딩 기능화 microtubules로 구성된 분자 셔틀. 여기 전형적인 셔틀 시스템의 조립이 설명되어 있습니다.
Abstract
세포는화물의 적극적인 세포내 수송을 지원하기 위해, 이러한 kinesin 모터 단백질 및 미세 소관의 필라멘트로 복잡한 분자 기계를 발전시켜 왔습니다. kinesins 꼬리 도메인화물의 다양한 바인딩 있지만, kinesins 머리 도메인은 미세 소관을 따라 격자 단계로 ATP 분자에 저장된 화학 에너지를 활용. 길고 뻣뻣한 microtubules는 장거리 세포내 전송을위한 트랙으로 제공하고 있습니다.
이러한 모터 및 필라멘트는 분자 셔틀 하나의 구성 요소로서 microfabricated 합성 환경에서 근무하실 수 있습니다. 자주 사용되는 디자인, kinesin 모터 자신의 꼬리를 통해 트랙 표면에 고정하고, 기능화 microtubules이 모터에 의해 추진 아르화물 운송 요소로 제공하고 있습니다. 이 셔틀은 비오틴과 streptavidin 사이의 강력하고 선택 바인딩을 이용하여화물로 로드할 수 있습니다. 주요 구성 요소 (biotinylated tubulin, streptavidin과 biotinylated화물) 상업적으로 사용할 수 있습니다.
고전 거꾸로 운동성 분석 2 빌딩 분자 셔틀 건설 여기서 자세한 내용입니다. Kinesin 모터 단백질은 카제인과 precoated 표면에 adsorbed되며 microtubules는 biotinylated tubulin에서 polymerized kinesin을 준수하고 이후 rhodamine - 라벨 streptavidin과 함께 코팅하고 있습니다. ATP 농도는화물 3 로딩을위한 최적의 미세 소관 글라이딩 속도를 달성하는 subsaturating 농도에서 관리하고 있습니다. 마지막으로, 플루오레신 - 표시 nanospheres은화물로 추가됩니다 biotinylated. Nanospheres은 표면에 준수 글라이딩 microtubules와 nanospheres 사이의 충돌의 결과로 microtubules을 첨부합니다.
프로토콜은 쉽게 이러한 biotinylated DNA 4, 양자 점 5 biotinylated 항체 4-6 통해 항원의 다양한으로화물의 다양한 로드할 수 수정할 수 있습니다.
Protocol
1.) 버퍼 및 시약
이러한 솔루션은 사전에 준비하고 편리하게 크기 aliquots에 보관해야합니다. 나누어지는는 전형적인 실험과 신선한 나누어지는 각 운동성 분석을 위해 사용되어야에 대한 충분한 해결책을 포함해야합니다. 저장 조건 및 전형 나누어지는 크기는 다음과 같은 프로토콜에 언급하고 있습니다.
1. BRB80 버퍼 (80 MM 파이프, 1 MM MgCl 2, deionized 소주 1 MM EGTA (DD) 물, 코에서 6.9로 조정 PH)
- DD 물에 0.5 M EGTA의 100 ML 주식 솔루션을 확인하십시오. 2 M NaOH 용액을 사용하여 7.0으로 산도를 조정합니다.
- DD 물 1 M MgCl 2 100 ML 주식 솔루션을 확인하십시오. 솔루션을 압력솥.
- 파이프와 DD의 물을 약 800 ML에 3.1 g 코 알약의 24.2 g을 추가하고 디졸브로 저어. 1 M 코 솔루션을 사용하여 6.9으로 산도를 조정합니다. 0.5 M EGTA 주식 솔루션과 1 M MgCl 2 주식 솔루션 1 ML 2 ML을 추가합니다. DD 물로 볼륨 1000 ML로 가져 오십시오.
- 나중에 사용하기 위해 -20 ° C 50 ML 팔콘 튜브 및 동결로 나누어지는. BRB80 튜브 현재 사용중인 4 ° C 또는 상온에서 저장할 수 있습니다.
2. 마그네슘 염화물 MgCl 2 (DD 물을 100 ㎜)
- 100 mm의 최종 농도를 달성하기위한 DD의 물에 희석.
- 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 저장소로 나누어지는 (10 μL 볼륨)
3. 구아 노신 5' - 삼인산 -, 나트륨 소금, GTP (NaOH에 의해 7 조정 DD 물, pH를 25 ㎜)
- 밖으로 무게와 DD 물에 용해 2 M NaOH 용액에 의해 7 산도를 조정합니다.
- 260 nm의 UV 흡광도에서 측정하여 농도를 확인합니다. (11.7 X 103 M -1 cm -1의 흡광 계수를 사용하여).
- 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (10 μL 볼륨).
4. 디메틸 sulfoxide, DMSO
- 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (10 μL 볼륨).
5. Taxol (DMSO 1 ㎜)
- 밖으로 무게 1 mm의 최종 농도를 달성하기 퓸 후드 아래에 DMSO에 용해.
- 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨).
6. D - (+) - 포도당 (DD 물 2 M)
- 밖으로 무게 2 M.의 최종 농도를 달성하기위한 DD의 물에 용해
- 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨).
7. 포도당 산화 효소 (BRB80 2 MG / ML)
- 2 MG / ML의 최종 농도를 달성하기 위해 BRB80에 디졸브.
- 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨).
8. Dithiothreitol, DTT (DD 물 1 M)
- 1 M.의 최종 농도를 달성하기 퓸 후드 아래에 DD 물에 용해
- 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨).
9. 카탈 라 아제 (BRB80의 0.8 MG / ML)
- 0.8 MG / ML의 최종 농도를 달성하기위한 최소한 2 단계에서 BRB80에 용해. 276 NM 및 406 nm의 (276 NM에서 3.1 X 10 5 M -1 cm -1 및 2.2 X 10 5 M -1 cm 406 nm의에서 -1의 흡광 계수를 사용하여 UV 흡광도에서 측정하여 각 단계에서 농도를 확인하고 방정식 A = CL).
- 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨).
10. 아데노신 5' - 삼인산 -, ATP (100mM MgCl 2 100 ㎜)
- DD 물 100 MM MgCl 2 주식 솔루션을 준비합니다. 건조 분말을 무게와 100mM의 최종 농도를 달성하기위한이 주식 솔루션 디졸브.
- 260 nm의 UV 흡광도에서 측정하여 농도를 확인합니다. (15.4 × 10 3 M -1 cm -1의 흡광 계수를 사용하여).
- 0.5 ML microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장소로 나누어지는 (20 μL 볼륨).
11. 카제인 용액 (BRB80 20 MG / ML 카제인)
- 50 ML 팔콘 튜브 30 ML의 DD 물을 약 3g 카제인을 추가합니다. 약 1 시간 동안 소용돌이 솔루션까지 두꺼운 일관성을 개발하고 있습니다.
- 30 분 정도 1만5천그램에서 원심 분리기. 0.5 μm의 및 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 뜨는을 필터링합니다.
- 280 NM (0.67 ML MG -1 cm -1의 흡광 계수를 사용)에서 UV 흡광도를 측정하여 표면에 뜨는의 농도를 결정합니다. 20 BRB80의 MG / ML로 희석.
- 나누어지는 (20 μL 볼륨)에0.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 저장하는.
2.) 표준 솔루션
이들은 실험 당일 준비하고 실험이 끝난 후 폐기하여야한다. 각 1 ML을 준비합니다.
1. BRB80CS0.5
- BRB80 얼음 이상 0.5 MG / ML 및 저장소의 최종 농도 카제인 솔루션을 희석. 이 솔루션은 이전 kinesin에 흐름 세포에 도입하여 표면에 흡착 후 kinesin 활동을 유지하는 데 도움이됩니다.
2. BRB80CA
- BRB80 얼음 이상의 저장소에있는 0.2 MG / ML 카제인 1 MM ATP를 준비합니다. Kinesin은 더욱 흐름 세포에 도입하기 전에이 솔루션을 사용하여 희석합니다.
3. BRB80T
- BRB80에 상온에서 10 μm의 및 저장소의 최종 농도 taxol 솔루션을 희석. 이 솔루션은 microtubules을 안정화하는 데 사용됩니다.
4. BRB80CT
- 10 μm의의 taxol과 BRB80 0.2 MG / ML 카제인과 실온에서 저장을 준비합니다. 이것은 더욱 antifade와 미세 소관 솔루션을 준비하는 데 사용됩니다.
5. BRB80AF
- 20 MM D - 글루코오스, 20 μg / ML 포도당 산화 효소, 카탈 라 아제 8 μg / ML, 10 MM의 DTT, 그리고 BRB80CT 20 μm의 ATP와 실온에서 저장을 준비합니다. 이 솔루션은 streptavidin과 nanospheres을 희석하기 위해 사용되며 흐름 세포에있는 여분의 streptavidin "를 씻어"입니다. kinesin 속도는이 솔루션의 ATP 농도를 조절하여 제어할 수 있습니다.
3.) Kinesin 준비
- 익스프레스 kinesin는 야생 형, 전체 길이 Drosophila melanogaster kinesin 중쇄 및 C - 터미널 대장균에서 그의 태그 구성된를 구축 6에서 설명한 니켈 NTA 칼럼을 사용하여 정화.
- -80에서 0.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 aliquots (10 μL 각)를 확인하면 ° C 나중에 사용하기 위해. 이러한 aliquots에 적극적으로 kinesin의 농도는 약 200 nm의 수 있습니다. 7
- 전형적인 실험은 kinesin 솔루션에게 BRB80CA 20 배 희석. 얼음을 통해 솔루션 KIN20하고 저장을 라벨.
4.) 미세 소관 준비
- 0.5 ML의 microcentrifuge 관에서 성장 솔루션을 25 μL를 준비 : 4 MM에게 MgCl 2, 1 MM GTP와 5% DMSO (V / V)를 BRB80 버퍼 인치
- 동결 건조된 biotinylated tubulin의 20 μg의 나누어지는이 솔루션의 6.25 μL를 추가합니다.
- 37 열 욕탕에 소용돌이 다음 장소 ° 중합 30 분 C. 부드럽게 BRB80T과 와동 100 배 희석. 상온에서 솔루션 MT100하고 저장을 라벨.
- BRB80AF에 MT100의 10 배 희석하십시오. 솔루션 MT1000을 라벨.
5.) Streptavidin 및 Nanosphere 솔루션
BRB80AF 100 NM의 농도에 AlexaFluor568 - 라벨 streptavidin을 준비합니다. 얼음 위에는 STV100 및 저장 라벨. 마찬가지로, BRB80AF 솔루션 nanospheres 5,000 배 희석. 얼음 통해 NS5000하고 저장을 라벨.
6.) 플로우 셀 건설
양면 테이프로 분리된 두개의 유리 coverslips를 사용하여 flowcell을 구성. 이 흐름 세포는 1cm 폭 및 100 μm의 높이 약 2cm 길이이며, 약 20 μL의 볼륨을했다. 솔루션은 종이 필터를 사용하여 다른에서 피펫과 악한 아웃를 사용하여 한쪽의 흐름 세포에 도입하고 있습니다.
7.) 인버티드 분석 어셈블리
유리 표면 처음 kinesin가 흡착시 그 기능을 유지할 수 카제인과 코팅입니다. kinesin가 adsorbed되면 microtubules은 kinesin에 의해 개최되는, 소개하고 있습니다. Microtubules 그때 형광 streptavidin과 함께 코팅하고 있습니다. 초과 streptavidin을 세척 후 biotinylated 폴리스티렌 플루오레신 nanospheres (40 나노미터 직경)을 소개합니다. 표면 adsorbed 고정 nanospheres은 이동 microtubules과 충돌하고 (그림 1)에로드하십시오.
다음 솔루션의 도입 전에 허용되는 솔루션과 시간의 흐름의 순서는 다음과 같습니다.
- BRB80CS0.5 5 분
- KIN20 5 분
- MT1000 5 분
- STV100 5 분
- BRB80AF, 배
- NS5000
8.) 현미경
즉시 nanosphere 소개 후 현미경 단계에있는 흐름 전지를 탑재합니다. 본 실험에서는 이클립스 TE2000 - U 형광 현미경 (니콘, 멜빌, NY) 100X 오일 목표 (NA 1.45), X - 인용 120 램프 (EXFO, 온타리오, 캐나다)과 iXon EMCCD 카메라 (ANDOR을 갖춘 사우스 윈저, CT)가 사용되었다. FITC 필터 큐브 (# 48001)과 TRITC 필터 큐브는 (# 48002, 채도 테크놀로지, 로킹엄, VT) 이미지 nanospheres와 microtubules respecti하는 데 사용되었다vely 흐름 세포의 바닥 표면에. 노출 사이의 시간 2 S. 동안 노출 시간, 0.2s되었습니다
그림 1. 분자 셔틀의 개략도 그림.
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Discussion
사소한 수정이 프로토콜은 성공적으로 kinesin - 미세 소관 운동성 기반의 assays를 조립하는 그룹의 다양한 의해 사용되고 있습니다. 최종 운동성 솔루션 10 MM의 DTT는 0.5 % β - 메르 캅 토 에탄올로 대체 수 있습니다. 2 시간 이상 된 표준 솔루션 (BRB80AF, KIN20 및 MT1000) 사용해서는 안됩니다. 특히 taxol과 microtubules를 포함한 모든 솔루션은 얼음에 배치해서는 안됩니다. 기능 구성 요소 photodamage의 UV 여기 광 결과에 흐름 세포의 과도한 노출 :. 흐름 세포 이러한 폴리스티렌 nanospheres로 높은 산소 확산과 폴리머를 포함하는 경우 microtubules와 kinesin 8이 효과는 더욱 발음 9.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 그의 그룹 이후 회사에 의해 조정되었다 글라이딩 운동성 분석을위한 기본 프로토콜을 개발 조나단 하워드에 크게 빚을 수 있습니다. NSF 그랜트 DMR0645023의 재정 지원은 기꺼이 인정받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | |
| Biotin tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | |
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Group | 106399 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
References
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